桑枝多糖預(yù)防性給藥對腎缺血再灌注損傷模型小鼠炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究Δ

黃倩，林佩璜，鄭丹丹，黃秋虹，王梅愛，陳慧勤，施子祿（.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理教研室，福建泉州 36200；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建泉州 362000）

腎缺血再灌注損傷（RIRI）是造成臨床急性腎衰竭的高危因素，其病理機(jī)制復(fù)雜，可能與再灌注后繼發(fā)的急性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]。Toll樣受體4（TLR4）是TLR家族中發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣泛的模式識別受體之一，研究發(fā)現(xiàn)，TLR4能夠特異性識別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖，并通過啟動髓樣分化因子88和Toll白細(xì)胞介素受體兩條信號通路介導(dǎo)多種促炎因子的釋放[2]。此外，TLR4也可引起絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]的活化，而作為MAPKs系統(tǒng)家族成員之一的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）可能在RIRI中發(fā)揮著重要的作用[4]，如李榮山等[5]采用p38MAPK特異性抑制劑SB203580抑制RIRI引起的p38MAPK信號通路的激活后，腎損傷得到明顯緩解。另有研究發(fā)現(xiàn)，在肝炎[6]或糖尿病腎病[7]時，TLR4可誘導(dǎo)p38MAPK的活化，進(jìn)而確定了TLR4與p38MAPK間的上下游關(guān)系。

桑枝多糖（Ramulus moripolysaccharides，RMP）是從?？浦参锷洌∕orus albaL.）的干燥樹枝及嫩枝中提取得到的一種水溶性雜多糖，具有降糖、調(diào)脂、抗炎、抗氧化等多種藥理活性。有研究表明，桑枝及其提取物均可明顯減輕小鼠腦缺血組織損傷[8-9]，而作為主要活性成分的RMP對腎臟有著很好的保護(hù)作用[10]。然而，目前對RMP的研究多集中于糖尿病或糖尿病腎病[10]，而關(guān)于其對RIRI的研究迄今未見文獻(xiàn)報道?；诖耍狙芯繑M通過建立小鼠RIRI模型，觀察RMP預(yù)防性給藥是否對RIRI小鼠有保護(hù)作用，并從TLR4/p38MAPK通路探討其可能的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7100全自動生化分析儀（日本日立公司）；UVmini-1240紫外-可見分光光度計[日本島津國際貿(mào)易（上海）有限公司]；ELX800光吸收酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；CX31-32C02光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；5810高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；MU4200DUVF超純水儀（上海淼康實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑枝采于浙江大學(xué)華家池校區(qū)桑園內(nèi)，經(jīng)浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張素萍博士鑒定為?？浦参锷涞母稍锬壑?；阿托伐他汀片（大連輝瑞制藥有限公司，批號：111010K，規(guī)格：10 mg）；小鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-10酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號：E-EL-M0037、E-EL-M0046）；IL-6、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：EK0411、YM-U6120）；兔源性抗TLR4多克隆抗體（批號：ab13556）、兔源性抗p38MAPK單克隆抗體（批號：ab170099）、兔源性抗磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）多克隆抗體（批號：ab4822）和內(nèi)參兔源性抗β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號：ab8227）均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（批號：A0208）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號：P0015）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物

60只成年C57BL/6小鼠，♂，8～12周齡，SPF級，體質(zhì)量21～25 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[使用許可證號：SYXK（滬）2017-0005]。飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，5只/籠，飼養(yǎng)于人工黑暗和光照交替（12 h/12 h）、溫度在22℃左右、濕度在50%左右的環(huán)境中。

2 方法

2.1 RMP的提取與精制

桑枝切片后于45℃烘箱中烘干，粉碎備用。取桑枝粗粉50 g，按一定比例加入石油醚500 mL，90℃水浴中回流1 h，抽濾。濾渣揮發(fā)干后，加80%乙醇500 mL，100℃水浴中回流提取2次，每次1 h，抽濾。待濾渣揮干后，加入雙蒸水500 mL，超聲（頻率：80 kHz，功率：220 W）處理40 min，100℃水浴中回流提取2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，經(jīng)40 000 r/min離心10 min，收集上清液，真空干燥后得濃縮液200 mL，加入一定體積乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%，充分拌勻后，4℃靜置過夜，抽濾，收集沉淀物，即為桑枝粗多糖。將粗多糖置于蒸餾水中溶解，Sevage法多次萃取后除去蛋白質(zhì)，流動自來水連續(xù)透析48 h，再用雙蒸水連續(xù)透析24 h，在透析液中加入一定體積乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%，充分拌勻后，4℃靜置過夜，抽濾，45℃真空干燥，所得即為精制RMP，經(jīng)紫外光譜[11]測定樣品中的RMP純度達(dá)86.3%。

2.2 RIRI模型的制備

RIRI模型的具體制備過程如下[12-13]：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉小鼠，于腹正中線行縱行切口（2.0～2.5 cm），暴露并游離雙側(cè)腎臟腎蒂。用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎臟腎蒂，阻斷45 min后，去除動脈夾恢復(fù)血流再灌24 h。模型制備成功的判定標(biāo)準(zhǔn)[13]：術(shù)中小鼠腎臟由鮮紅色變成紫黑色，去除動脈夾后，腎臟又由紫黑色轉(zhuǎn)為鮮紅色，且術(shù)后3 h內(nèi)小鼠恢復(fù)清醒。假手術(shù)組小鼠僅打開腹腔并分離雙側(cè)腎臟腎蒂，不予夾閉。

2.3 分組與給藥

將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成6組，即假手術(shù)組、模型組、阿托伐他汀組（陽性對照，15 mg/kg）[14]和RMP低、中、高劑量（300、600、1 200 mg/kg）[10]，每組10只。4個給藥組小鼠于術(shù)前1周每天同一時間點(diǎn)分別灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。末次給藥1 h后，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行手術(shù)。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 血清中Scr和BUN水平的檢測 缺血45 min再灌注24 h后，各組選取7只小鼠（因造模過程中造模組均有2～3只小鼠造模失敗，故最終每組選7只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），麻醉后下腔靜脈取血，室溫靜置1 h，待血液自然凝固后以3 000 r/min離心10 min，收集血清。取部分血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中Scr和BUN水平。

2.4.2 腎臟病理組織學(xué)變化觀察 取血后，將小鼠迅速處死并取相同部位腎組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（3 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察其腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4.3 血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平檢測 取“2.4.1”項(xiàng)下剩余部分血清，按照ELISA試劑盒上的步驟檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2.4.4 腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平檢測 各組選取6只小鼠[因人為因素，造成RMP高劑量組小鼠皮質(zhì)（1份）損壞，為保證每組數(shù)量統(tǒng)一，最終每組選擇6只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)]取相同部位腎皮質(zhì)，冰上玻璃勻漿器研磨組織后加相應(yīng)比例（20 mg/200 μL）預(yù)冷的蛋白裂解液，繼續(xù)研磨至勻漿，然后在4℃下以14 000 r/min離心5 min，留上清。取30 μL上清液采用二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白樣品（30 μg）進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后以260 mA恒流電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（PVDF膜）上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，置于含5%脫脂奶粉的洗滌液中室溫封閉1 h，分別加入TLR4抗體（1∶1 000）、p38MAPK抗體（1∶3 000）、p-p38MAPK抗體（1∶1 000）和內(nèi)參β-actin抗體（1∶3 000），4 ℃搖床過夜，次日洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1.5 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光、顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組蛋白條帶的光密度值，以目的蛋白光密度值與β-actin光密度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RMP預(yù)防性給藥對RIRI模型小鼠血清中Scr和BUN水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中Scr和BUN水平明顯升高（P＜0.01），提示RIRI造模成功；與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠血清中Scr和BUN水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明RMP預(yù)防性給藥能夠減輕小鼠RIRI癥狀。各組小鼠血清中Scr和BUN水平測定結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清中Scr、BUN水平測定結(jié)果（±s，n＝7）Tab 1 Serum levels of Scr and BUN of mice in each group（±s，n＝7）

表1 各組小鼠血清中Scr、BUN水平測定結(jié)果（±s，n＝7）Tab 1 Serum levels of Scr and BUN of mice in each group（±s，n＝7）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

BUN，mmol/L 6.59±0.64 35.27±3.69＊＊19.54±2.41##29.55±3.02#24.48±2.87##19.87±2.42##組別假手術(shù)組模型組阿托伐他汀組RMP低劑量組RMP中劑量組RMP高劑量組劑量，mg/kg 15 300 600 1 200 Scr，μmol/L 21.35±2.54 175.61±20.38＊＊80.42±9.28##124.57±14.26#106.48±11.59##83.76±9.44##

3.2 RMP預(yù)防性給藥對RIRI模型小鼠腎臟病理組織學(xué)變化的影響

假手術(shù)組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊。模型組小鼠腎組織中腎小管上皮細(xì)胞大量變性壞死、脫落，腎小管管腔明顯擴(kuò)張，管腔中可見管型，間質(zhì)充血與炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠腎臟病理損傷均得到不同程度改善，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死、脫落程度、炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕，其中RMP中、高劑量組較為效果顯著，但RMP低劑量組效果不明顯，這說明中、高劑量RMP預(yù)防性給藥能夠減輕RIRI模型小鼠腎組織病理損傷，結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟病理組織學(xué)觀察結(jié)果（×200）Fig 1 Observation of renal histopathological of mice in each group（×200）

3.3 RMP預(yù)防性給藥對RIRI模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠血清中IL-1β和IL-6水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），阿托伐他汀組和RMP高劑量組小鼠血清中IL-10水平進(jìn)一步升高（P＜0.05），阿托伐他汀組和RMP中、高劑量組小鼠血清中TNF-α水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），這表明RMP預(yù)防性給藥能夠減輕RIRI后的炎癥損傷，且以RMP中、高劑量效果最為明顯，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平測定結(jié)果（±s，n＝7，ng/L）Tab 2 Serum levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α of mice in each group（±s，n＝7，ng/L）

表2 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平測定結(jié)果（±s，n＝7，ng/L）Tab 2 Serum levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α of mice in each group（±s，n＝7，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α 38.65±1.97 81.24±5.35＊＊55.47±4.07##78.57±5.26 69.46±4.78#57.12±4.16##組別假手術(shù)組模型組阿托伐他汀組RMP低劑量組RMP中劑量組RMP高劑量組劑量，mg/kg 15 300 600 1 200 IL-1β 3.14±0.12 9.55±0.54＊＊5.21±0.24##7.43±0.46#6.01±0.39##5.63±0.36##IL-6 52.67±2.16 85.83±4.15＊＊58.65±3.43##71.47±4.06#70.68±3.98#64.31±3.55##IL-10 18.57±0.56 22.62±0.85＊＊32.75±1.33##22.75±0.85 23.16±0.91 30.42±1.27##

3.4 RMP預(yù)防性給藥對RIRI模型小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組和RMP各劑量組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4和p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明RMP對RIRI小鼠的抗炎作用可能與抑制TLR4/p38MAPK信號通路激活有關(guān)。各組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表3。

圖2 各組小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoregram of protein expressions of TLR4，p38MAPK and p-p38MAPK in renal cortex of mice in each group

表 3 各組小鼠腎皮質(zhì)中 TLR4、p38MAPK、pp38MAPK蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（x±s，n＝6）Tab 3 Protein expressions of TLR4，p38MAPK and p-p38MAPK in renal cortex of mice in each group（x±s，n＝6）

4 討論

組織或器官缺血后再恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)，往往會引起更為嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙[15]。腎臟作為高灌注器官，對缺血及再灌注均比較敏感[16]，缺血會導(dǎo)致腎血流量下降，腎小管阻塞，嚴(yán)重者腎小管壞死，導(dǎo)致再灌注后腎損傷，甚至引起急性腎衰竭[17]。因此，抑制再灌注損傷是預(yù)防缺血性急性腎衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血清Scr和BUN水平在一定程度上可反映腎功能的損害程度，是常用的觀察腎功能狀況的指標(biāo)。本研究通過構(gòu)建RIRI小鼠模型，觀察RMP預(yù)防性給藥對小鼠RIRI的保護(hù)作用，結(jié)果顯示RMP預(yù)防性給藥能夠減輕RIRI小鼠的腎功能，明顯降低其血清中Scr及BUN水平，同時，病理切片也證實(shí)了RMP對小鼠腎臟結(jié)構(gòu)損傷的改善作用。阿托伐他汀對預(yù)防RIRI具有積極的作用，研究顯示阿托伐他汀可能通過TLR4信號途徑發(fā)揮其非依賴降血脂的腎臟保護(hù)作用[14]，按照公認(rèn)有效、同類可比的原則，故選用阿托伐他汀作為本研究的陽性對照藥。

RIRI發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡、鈣超載等，而炎癥損傷在其發(fā)病過程中具有重要作用[18]。TLR4/p38MAPK是介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及細(xì)胞炎癥等作用的關(guān)鍵性信號通路，近年來，細(xì)胞內(nèi)TLR4/p38MAPK信號通路的活化在器官缺血再灌注損傷中的作用備受關(guān)注。有研究顯示，發(fā)生肝缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺衰竭[19]或缺血再灌注心肌損傷時[20]，TLR4/p38MAPK信號通路均被激活，通過促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和凋亡誘導(dǎo)因子生成等許多途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而在缺血再灌注損傷病理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后，小鼠腎皮質(zhì)中TLR4、p38MAPK以及p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平均明顯升高，說明TLR4/p38MAPK信號通路被激活，而RMP預(yù)防性給藥后能不同程度地抑制RIRI誘導(dǎo)的TLR4和p-p38MAPK蛋白高表達(dá)，從而使TLR4/p38MAPK信號通路失活，這可能是其發(fā)揮腎保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。

另有研究表明，臟器缺血后TLR4/p38MAPK信號通路的激活使組織中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞大量活化，產(chǎn)生和分泌大量炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子多具有免疫調(diào)節(jié)作用，廣泛參與細(xì)胞生長、分化、修復(fù)和免疫過程，此外，炎性細(xì)胞因子密切關(guān)聯(lián)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞因子反應(yīng)逐級放大的瀑布效應(yīng)，進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。炎性細(xì)胞因子包括促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α等）和抗炎細(xì)胞因子（IL-10等），促炎細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)和延續(xù)中起主要作用，而抗炎細(xì)胞因子可反過來抑制炎癥細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子等細(xì)胞因子，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的失衡被認(rèn)為是RIRI發(fā)生的基礎(chǔ)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后，小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平明顯升高，RMP預(yù)防性給藥后能不同程度地抑制RIRI引起的血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高，并且高劑量RMP還能進(jìn)一步升高血清IL-10水平，說明RMP具有減輕缺血損傷后炎性細(xì)胞因子瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)抗炎效應(yīng)，從而發(fā)揮其對RIRI小鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，RMP預(yù)防性給藥對RIRI小鼠的保護(hù)作用可能與抑制TLR4/p38MAPK信號通路激活，進(jìn)而改善腎功能，減輕腎臟病理損傷，減輕炎癥損傷，增強(qiáng)抗炎等作用有關(guān)。