多指標綜合評分結合響應面法優(yōu)選金卷升板膠囊的超聲提取工藝Δ

王玲嬌，高先，劉清池，楊繼章，孫國祥，于靜#（.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院藥學部，石家莊0500；.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院智慧醫(yī)療部，石家莊 0500；.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院血液科，石家莊 0500；.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 006）

金卷升板方是依據(jù)河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院血液科劉清池主任多年臨床實踐的協(xié)定處方而組方的，擬將其開發(fā)成院內膠囊制劑，該方主要由金銀花、黃芩、地錦草、熟大黃等常見中藥材組成，具有解毒散瘀、清熱涼血、止血通絡之功效，主治原發(fā)性免疫性血小板減少癥（ITP）[1-3]。處方中君藥金銀花性寒味甘，清熱解毒、涼血化瘀，具有抗病毒、抗炎、解熱止血、調節(jié)免疫等功效，主要成分為綠原酸[4-5]；臣藥黃芩主治溫熱病，具有清熱解毒、凝血排毒、抗過敏、調節(jié)免疫等功效，黃芩苷為其主要活性成分[6-7]；佐藥地錦草涼血散血、解毒止痢，具有抗菌、抗炎、抗過敏、免疫調節(jié)、保肝止血等作用，主要成分為沒食子酸[8-9]；使藥熟大黃瀉熱通腸、涼血解毒，具有瀉火涼血、清熱化濕、逐瘀通經(jīng)的功效，主要成分為蒽醌類衍生物蘆薈大黃素、大黃素甲醚[10-11]。

利用超聲波技術提取中藥中有效成分具有操作溫度低、處理時間短、提取效率高、生產成本低等優(yōu)點[12-13]。本研究按照處方中各藥材有效成分的理化性質，以綠原酸、黃芩苷、沒食子酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚的轉移率為綜合評價指標，采用多指標綜合評分結合響應面法[14-15]對金卷升板膠囊的超聲波提取工藝進行優(yōu)化，為其后續(xù)的制劑開發(fā)與生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200系列高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）；Sartorius BS 110S分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-500KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DST-50L聚能式超聲波提取機組（上海矩源機械設備有限公司）；JP-800B-8高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）。

1.2 藥品與試劑

金銀花（批號：180801CP193）、白術（批號：180201-CP270）、地錦草（批號：180701CP383）、卷柏（批號：180101CP404）、茜草（批號：180601CP608）、山藥（批號：180802CP016）、水牛角（批號：180101CP493）均購自河北萬修藥業(yè)有限公司，黃芩（批號：20170302）、（熟）大黃（批號：20170502）均購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，紫草（批號：17041501）購自國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司，上述所有藥材經(jīng)河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院張一民主管中藥師鑒定均符合2015年版《中國藥典》（一部）的藥用標準；綠原酸（批號：17081021，純度：≥98%）、沒食子酸（批號：17062510，純度：≥98%）對照品均購自上海士鋒生物科技有限公司；黃芩苷（批號：110755-200101，純度：≥98%）、蘆薈大黃素（批號：110796-200802，純度：≥98%）、大黃素甲醚（批號：110724-200611，純度：≥98%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，水為市售娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 5個有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相：0.1%乙酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫；檢測波長：275 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。分別取“2.1.2”和“2.1.3”項下供試品溶液（“2.4.2”項下1號提取液）和混合對照品溶液進樣分析。結果，各相鄰峰間分離度均大于1.5，理論板數(shù)按黃芩苷峰計大于4 000。梯度洗脫程序見表1，各溶液色譜圖見圖1。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取提取液1 mL至25 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，振蕩搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.3 混合對照品儲備液的制備 精密稱取沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚對照品1.34、6.19、6.46、1.81、3.21 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得，備用。

2.1.4 線性關系及定量限考察 分別量取“2.1.3”項下的對照品儲備液8、4、2、1、0.5 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以色譜峰面積（y）為縱坐標、待測物質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的回歸方程分別為y＝ 3 322.1x－2.283 3（r＝0.999 3）、y＝1 755.6x+91.063（r＝0.999 5）、y＝10 393x－170.92（r＝0.999 7）、y＝2 923.8x+83.299（r＝0.999 2）、y＝3 059.5x+97.55（r＝0.999 1）。結果表明，沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的檢測質量濃度線性范圍分別為1.07～17.21、4.92～79.34、5.08～83.69、1.34～23.14、2.58～42.07 μg/mL。按規(guī)定方法進行定量限（信噪比10∶1）考察，結果定量限分別為5.36、4.92、7.11、6.71、3.87 ng/mL。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.3”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。分別計算沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD，結果分別為1.78%、2.08%、1.30%、2.61%、1.42%（n＝6）。表明儀器精密度好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取“2.1.2”項下供試品溶液（“2.4.2”項下1號提取液），在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，記錄峰面積。分別計算沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.84%、1.06%、1.35%、1.93%、2.02%（n＝6）。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液（“2.4.2”項下1號提取液）6份，進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚峰含量的RSD分別為2.13%、1.57%、1.05%、1.78%、1.51%（n＝6）。表明方法重復性好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液（“2.4.2”項下1號提取液）9份，分別加入沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液并進樣分析，計算平均回收率。結果，分別為95.49%、98.51%、98.12%、100.03%、97.19%，RSD分別為2.17%、1.34%、1.67%、1.22%、1.57%（n＝9）。表明該方法準確度較好。

2.2 提取工藝考察指標的確定

參考前期試驗，考慮金卷升板膠囊的藥效部位為醇溶性部分，因此對醇提取工藝進行考察。根據(jù)預試驗結果選擇對超聲波的醇提效果可能有影響的因素，如乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲功率、超聲提取時間等作為考察因素。在單因素試驗基礎上結合Box-Behnken響應面法進行優(yōu)化，依次得到各試驗提取液。采用層次分析法（AHP）進行分析[16]，依據(jù)中藥的君臣佐使理念和制劑中各藥材的實際配比評價各指標成分在處方配比中的相對重要性進行權重分配：金銀花有效成分綠原酸，黃芩有效成分黃芩苷，黃芩為臣藥但藥材在處方中的實際配比高，故綠原酸和黃芩苷的權重同等；綠原酸和黃芩苷與地錦草的主要成分沒食子酸比較，綠原酸和黃芩苷相對重要，記3分；與熟大黃中有效成分蘆薈大黃素、大黃素甲醚比較，綠原酸和黃芩苷相對更重要，記5分；蘆薈大黃素、大黃素甲醚重要性相似，均記1分；其余以此類推，具體判斷矩陣見表2。

表2 權重記分判斷矩陣Tab 2 Judgment matrix of weight score

根據(jù)AHP進行計算，確定沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的權重系數(shù)分別為0.151 83、0.360 06、0.360 06、0.064 02、0.064 02 ，按權重對各指標成分轉移率[轉移率（%）＝藥液中指標成分總量/藥材中指標成分總量×100%]進行綜合評價，以綜合評分作為提取效果的評判依據(jù)。綜合評分（Y，%）＝?jīng)]食子酸轉移率×權重系數(shù)+綠原酸轉移率×權重系數(shù)+黃芩苷轉移率×權重系數(shù)+蘆薈大黃素轉移率×權重系數(shù)+大黃素甲醚轉移率×權重系數(shù)。

2.3 單因素試驗

2.3.1 乙醇體積分數(shù)考察 按處方比例2倍量稱取藥材150 g，分別加入不同體積分數(shù)的乙醇，在超聲功率300 W（頻率：40 kHz，下同）、液料比50∶1的條件下，超聲40 min，考察乙醇體積分數(shù)（10%、30%、50%、70%、95%）對綜合評分的影響。結果顯示，在10%～50%乙醇范圍內，綜合評分一直呈上升趨勢，70%乙醇后綜合評分下降，結合生產實際操作確定取70%乙醇為響應面試驗設計的考察水平，結果見圖2A。

圖2 單因素試驗考察結果Fig 2 Results of single factor tests

2.3.2 超聲提取時間考察 按處方比例2倍量稱取藥材150 g，在70%乙醇、液料比50∶1、功率300 W的情況下，分別考察超聲提取不同時間（10、20、30、40、50 min）對綜合評分的影響。結果顯示，超聲提取前30 min，綜合評分呈迅速上升趨勢，但40 min后增速緩慢，50 min時的綜合評分結果與40 min較為接近，結合生產實際操作確定超聲提取40 min為響應面試驗設計的考察水平，結果見圖2B。

2.3.3 超聲功率考察 按處方比例2倍量稱取藥材150 g，加入70%乙醇，在液料比50∶1、超聲40 min條件下，分別考察超聲功率（100、200、300、400、500 W）對綜合評分的影響。結果顯示，超聲功率增大至300 W時綜合評分值最大，之后隨著超聲功率的增大綜合評分反而下降?？紤]生產實際操作，選擇超聲功率300 W為響應面試驗設計考察水平，結果見圖2C。

2.3.4 液料比考察 按處方比例2倍量稱取藥材150 g，分別加入70%乙醇，在超聲功率300 W、超聲40 min條件下，考察液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）對綜合評分的影響。結果顯示，在液料比20∶1～40∶1范圍內綜合評分呈上升趨勢，60∶1較40∶1出現(xiàn)稍許下降。結合生產實際操作，取50∶1為響應面試驗設計的考察水平，結果見圖2D。

2.4 響應面法優(yōu)化提取條件

2.4.1 試驗設計 根據(jù)Box-Behnken響應面試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、超聲提取時間（B）、超聲功率（C）、液料比（D）為考察因素，按處方量精密稱取飲片，采用4因素3水平響應面分析法進行試驗設計，因素與水平見表3。

表3 因素與水平Tab 3 Factors and levels

2.4.2 試驗結果與方差分析 以沒食子酸、綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚轉移率為考察指標，按照AHP得到的權重系數(shù)進行計算得到綜合評分，試驗設計與結果見表4。

采用Design-expert 8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到綜合評分（Y）對各因素的回歸方程為Y＝88.27+2.78A+1.29B+1.52C+1.92D－2.69AB+0.09AC+0.17AD+0.24BC+1.37BD+0.75CD－5.11A2－3.63B2－6.47C2－4.91D2，R2＝0.984 8。方差分析結果見表5。

由表5可知，模型F＝12.51，P＜0.000 1，提示回歸模型極其顯著，失擬項F＝3.67，P＝0.111 0＞0.05，提示模型失擬度不顯著，可以用于分析試驗。由表中F值可知，模型的一次項影響順序是A＞D＞B＞C，交互項AB顯著，其余交互相均不顯著，二次項A2、C2、D2均極顯著（P＜0.000 1），B2比較顯著（P＜0.001）。

2.4.3 響應面試驗與工藝優(yōu)化結果 采用Design-expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到響應面見圖3。

由響應面圖的陡峭程度可知，A和D對綜合評分影響較大，交互項AB對綜合評分有顯著影響，其余交互項相對綜合評分無顯著影響，以綜合評分的回歸模型的極值分析得到最優(yōu)條件為：乙醇體積分數(shù)70.03%，超聲提取時間40.21 min，超聲功率300.44 W，液料比為50.34∶1；根據(jù)生產實際操作將最優(yōu)提取條件調整為乙醇體積分數(shù)70%，超聲提取時間40 min，超聲功率300 W，液料比50∶1，在此條件下綜合評分的預測值為88.27%。

2.4.4 驗證試驗 稱取10倍處方量750 g，藥材3份，粗粉碎后應用超聲波提取機組按上述最優(yōu)條件進行驗證試驗，計算綜合評分，結果見表6。

表4 試驗設計與結果Tab 4 Test design and results

表5 方差分析結果Tab 5 Results of variance analysis

由表6可知，綜合評分平均值為88.95%，結果與預測值接近，相對誤差為1.10%，提示該數(shù)學模型合理，且3次試驗各指標的RSD均小于3.57%（n＝3），提示優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可靠。

圖3 4種因素對綜合評分的響應面圖Fig 3 Response surface plot of 4 factors to comprehensive score

表6 驗證試驗結果Tab 6 Results of validation tests

3 討論

3.1 有效成分的選擇

中藥制劑的多組分、多靶點特點決定了不能選擇單一成分作為檢測指標，而劑量的配伍差異可能引起組方的功效發(fā)生變化，因此應從中藥的整體觀出發(fā)，選擇多個能夠發(fā)揮目標藥效的成分進行控制才能更好地達到中藥之間藥效整合的目的，從而建立更為臨床認可的穩(wěn)定、可行的方法[17-18]。

金卷升板膠囊的組方為10種常見的中藥材，是根據(jù)《金匱要略》的瀉心湯[19]和《幼科直言》的銀花解毒湯加減而成[20]，在長期臨床實踐中其療效得到了廣大患者的認可。本研究根據(jù)中藥的君臣佐使觀點，參考中醫(yī)治療ITP的涼血解毒理論，選擇該制劑中具有藥效物質基礎的多組分的代表成分進行研究。處方中君藥金銀花中的綠原酸，臣藥黃芩中的黃芩苷，佐藥地錦草中的沒食子酸，使藥大黃中的蘆薈大黃素、大黃素甲醚均為中醫(yī)涼血止血理論中治療 ITP 的有效成分[4，6，8，11]，因此將這 5個成分的含量作為考察指標，采用AHP對指標給予不同的權重并計算綜合評分來優(yōu)化工藝參數(shù)，不僅體現(xiàn)了方劑的配伍特點，也兼顧了臨床的藥效基礎。

3.2 提取與試驗方法的選擇

與正交試驗法比較，響應面法在尋找最優(yōu)條件的過程中可以連續(xù)分析各水平，兼顧了多個影響因素及各因素之間的交互作用，能夠更為準確地獲取到與真實試驗接近的最優(yōu)條件[21]。源于在長期的臨床觀察中屢有患者采取酒浸后服用得到了很好的治療效果，結合2015年版《中國藥典》（一部）中各單方藥材的主要成分的提取方法，本試驗選擇了醇提法為主要的提取方法。在預試驗中，分別考察了乙醇超聲提取法、乙醇浸泡法和水回流提取法對有效成分的影響，通過高效液相色譜法測定成分含量進行對比，發(fā)現(xiàn)水回流提取法和乙醇浸泡法的指標成分含量均低于乙醇超聲提取中的含量，且回流溫度過高、浸泡時間過長，均會導致有效成分發(fā)生分解；而超聲提取法不僅可以避免回流法的熱破壞和分解，而且比浸泡法的試驗步驟也更簡單易行，故選擇該法進行提取。結合響應面法優(yōu)選可影響試驗結果的各個因素和水平，從而使優(yōu)化的工藝參數(shù)更為穩(wěn)定、合理。

綜上，本文所得提取工藝方法簡便、穩(wěn)定，結果預測性好，可為金卷升板膠囊的制劑生產和藥效研究提供參考。