HPLC法同時(shí)測定三葉青塊根中6個(gè)黃酮類成分的含量Δ

李彩鳳，胡欣，金鵬飛，李清，孫淑仃，畢開順#，付宏征（.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽006；.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 009；.北京醫(yī)院藥學(xué)部，北京 0070）

三葉青即葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg.），又名金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠，全草均可入藥，以地下塊根藥用效果最好，具有清熱解毒、活血散結(jié)、消炎止痛、祛風(fēng)化痰、理氣健脾等功效，常用于小兒高熱驚厥、痢疾、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性腦膜炎、毒蛇咬傷、扁桃體炎、跌打損傷等疾病的治療[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，三葉青具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、保肝、解熱、鎮(zhèn)痛以及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2]。為了更好地開發(fā)利用三葉青資源，需對三葉青中的主要成分進(jìn)行質(zhì)量控制。目前，從三葉青中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分包括黃酮類、酚酸類、三萜類、甾類、二苯乙烯類、鞣質(zhì)類等[3-5]。相關(guān)研究采用高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（HPLC-Q-TOF-MS）或超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）法來測定三葉青中的化學(xué)成分[6-7]，但此類儀器價(jià)格昂貴，難以普及。另有研究采用HPLC法測定三葉青中化學(xué)成分的含量，但所測成分較少[8-10]。為了更好地控制三葉青的質(zhì)量，本研究選擇三葉青中具有抗腫瘤活性[11]的黃酮類成分蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚作為質(zhì)控成分，建立HPLC法同時(shí)測定三葉青中這6個(gè)黃酮類成分的含量，以期為三葉青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Alliance e2695 HPLC儀（美國沃特世公司）；MS-204TS電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；K-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士布琦公司）。

1.2 藥品與試劑

三葉青藥材從浙江省臺州市當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)購入（批號：20171012、20171020、20171107），經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物化學(xué)系付宏征教授鑒定為真品；蘆丁對照品（批號：201832，純度：98.21%）、異槲皮苷對照品（批號：201807，純度：97.26%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品（批號：201805，純度：96.63%）、紫云英苷對照品（批號201815，純度：99.33%）、槲皮素對照品（批號201819，純度：97.94%）、山柰酚對照品（批號：201814，純度：98.69%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Alliance SilGreen C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：15μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚對照品適量，置于不同量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的對照品貯備液；精密移取6種對照品貯備液適量，混合制成含有蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚質(zhì)量濃度分別為217.77、123.75、132.31、46.30、57.50、33.66 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三葉青塊根適量，粉碎，精密稱取三葉青粉末約4.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）60 min，放冷至室溫，稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干（40℃），用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至2 mL量瓶中，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對照品溶液和供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚各峰之間分離度良好，分離度均＞1.5，理論板數(shù)以蘆丁峰計(jì)＞40 000。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別取混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，6個(gè)黃酮類成分在各檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，6個(gè)黃酮類成分的線性關(guān)系結(jié)果見表2。

2.3.3 檢測限與定量限試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液加甲醇逐級稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)得檢測限，信噪比為10∶1時(shí)得定量限。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚的檢測限分別為0.217 8、0.123 8、0.066 2、0.046 3、0.191 7、0.112 3 μg/mL，定量限分別為 0.435 6、0.247 5、0.165 4、0.154 3、0.575 0、0.421 2 μg/mL。

表2 6個(gè)黃酮類成分的線性關(guān)系結(jié)果（n＝6）Tab 2 Linear relationship of 6 flavonoids（n＝6）

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.21%、0.63%、0.31%、0.47%、0.45%、0.67%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三葉青（批號：20171012），平行取樣6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為1.30%、1.20%、1.77%、1.67%、1.80%、1.87%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號：2017-1012），于室溫下放置0、2、6、8、10、12、24 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為2.18%、3.20%、3.08%、1.27%、1.14%、2.44%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的三葉青粉末（批號：20171012）9份，精密稱定適量，分別按各成分已知含量的50%、100%、150%加入混合對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚的平均加樣回收率分別為96.23%、86.88%、97.51%、97.67%、97.50%、87.46%，RSD分別為1.85%、1.90%、1.84%、1.94%、1.25%、2.01%（n＝9），回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Result of recovery tests

2.3.8 耐用性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號：20171012），分別在流速0.8、1.0、1.2 mL/min，柱溫 30、35、40℃，流動(dòng)相磷酸濃度0.15%、0.1%條件下進(jìn)樣分析，考察各成分峰之間的分離情況。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚之間分離度均＞1.5，各峰理論板數(shù)均大于10 000，表明該方法耐用性好。

2.3.9 樣品含量測定 3批樣品分別各取適量，粉碎，取粉末約4.0 g，各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量，樣品含量測定結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者前期首先將6個(gè)成分的對照品溶液在210～400 nm波長下進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)成分在360 nm波長處均有較大吸收，因此選擇360 nm為檢測波長。

3.2 色譜條件的選擇

筆者前期考察了不同性能填料的色譜柱Alliance SilGreen C18和MACHEREY-NAGEL NUCLEOSIL C18的分離效果，并從對稱因子、分析時(shí)間、分離度等方面對三葉青供試品溶液進(jìn)行綜合評價(jià)，最終選擇SilGreen C18色譜柱，該色譜柱分離的峰形良好，分析時(shí)間較短，且在較低柱壓下能實(shí)現(xiàn)快速高效的分離。筆者還考察了甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動(dòng)相，以及不同濃度磷酸水溶液0.1%、0.15%、0.2%對6個(gè)成分分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)具有良好的分離效果。

綜上所述，本研究建立的HPLC方法準(zhǔn)確度好、穩(wěn)定性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對三葉青塊根中6個(gè)黃酮類成分含量的同時(shí)測定，可為三葉青質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。但本方法只對三葉青中黃酮類成分進(jìn)行了定量分析，后續(xù)還應(yīng)對三葉青中其他化學(xué)成分（酚酸類、三萜類、甾類和二苯乙烯類等）進(jìn)行定量分析，建立三葉青中多指標(biāo)成分含量的分析方法，進(jìn)一步完善三葉青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。