HPLC-一測多評法測定黃精及其飲片中6種成分的含量Δ

左雅敏，李琛，彭興春，衛(wèi)榮華，伍慶，鄭燕，鄧雪華#（.湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院，湖北十堰44000；.貴州師范大學山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴陽 55000；.湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北十堰 44000）

黃精為百合科植物滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricumRed.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）的干燥根莖[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃精的化學成分主要有糖類、皂苷類、黃酮類、酚酸類及生物堿類等[2-4]。其中，皂苷類成分薯蕷皂苷元還可改善心血管功能、調節(jié)免疫等[5]；黃酮類成分蘆丁、槲皮素及山柰酚等可通過參與蛋白質磷酸化、氧化還原反應及自由基清除等在抗氧化、抗衰老方面發(fā)揮重要作用[6]；酚酸類成分香草酸具有抗菌、消炎及抗血小板聚集等功能[7]。因生黃精有麻舌感且可刺激咽喉，故臨床上多通過酒制法破壞黃精中黏液質以減少毒副作用[8-9]。而相關研究證實[10-11]，黃精酒制前后多糖含量變化較大，在炮制過程中多糖會被大量水解成低聚糖和單糖，其中的5-羥甲基糠醛就是葡萄糖等多糖在高溫或弱酸等條件下脫水產生的，可作為炮制過程黃精多糖成分變化的重要指標，且其具有抗炎和改善血液流變學的功效。以上6種成分均具有較好的藥理作用，具有較大的研究價值和開發(fā)潛力。

一測多評（QAMS）法是以樣品中某一典型組分為內參物，建立該組分與其他組分的相對校正因子（RCFs），以計算其他組分的量[12]，該方法已成功應用于多種藥材、飲片及中成藥的質量控制中[13-14]。而王智民課題組成功建立的含淫羊藿成分的“藥材-飲片-中成藥”一體化QAMS質量評價模式為實現(xiàn)單味藥材到復方的推廣提供了示范和參考作用[15]。另有研究證實，使用紫外雙波長切換可有效提高檢測靈敏度，實現(xiàn)同時測定藥材中不同成分含量的目的[16]。目前，2015年版《中國藥典》（一部）[1]僅以黃精飲片中無水葡萄糖的含量不少于4.0%作為質量標準，雖有研究采用外標法對黃精中黃酮、生物堿等成分進行了測定[17-19]，但未見QAMS法的報道。且已報道的研究多局限于探討黃精多糖的藥理作用，而同時測定多種類型化學成分的研究則報道較少。為體現(xiàn)中藥黃精多成分、多層次和多靶點的特點，充分開發(fā)利用藥用資源，本研究以黃精藥材及其飲片為研究對象，以香草酸（酚酸類）作為內參物，建立黃精藥材及其飲片中薯蕷皂苷元（皂苷類）、蘆丁、槲皮素及山柰酚（黃酮類）和5-羥甲基糠醛（醛類）6種成分的QAMS法，并與高效液相色譜（HPLC）外標法進行對比，為全面建立黃精藥材及飲片質量提供參考，同時為揭示黃精炮制機制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)，包括四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器（DAD）及Agilent ChemStation B.04.02型工作站（美國Agilent公司）；CH-250型超聲波清洗機（北京創(chuàng)新德超聲電子研究所）；AL-204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；WG-43型數(shù)顯電熱鼓風恒溫干燥箱（長春澳爾天派機電設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

薯蕷皂苷元對照品（批號：111539-200001，純度：＞99%）、5-羥甲基糠醛對照品（批號：111626-201711，純度：＞99%）、香草酸對照品（批號：110776-201503，純度：＞99%）、蘆丁對照品（批號：100080-201811，純度：＞98%）、槲皮素對照品（批號：100081-201610，純度：＞99%）和山柰酚對照品（批號：110861-201812，純度：＞99%）均購自中國食品藥品檢定研究院；黃精藥材（批號：20181201～20181210）和黃精飲片（批號：20181211～20181220）各10批，均購自國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司，經貴陽中醫(yī)學院魏升華教授鑒定均符合2015年版《中國藥典》（一部）相關規(guī)定，屬于多花黃精P.cyrtonemaHua的干燥塊莖；甲醇、乙腈（天津科密歐化學試劑有限公司，色譜純），水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定黃精藥材及飲片中6種成分含量

2.1.1 各對照品溶液的制備 對照品貯備液：分別取薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚對照品適量，精密稱定，置于不同10 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并定容至刻度，得質量濃度分別為0.62、3.34、2.15、1.65、1.13、1.08 mg/mL的對照品貯備液。混合對照品溶液：分別移取適量上述6種對照品貯備液，置于同一5 mL量瓶中，用80%甲醇制備成含有0.010 2 mg/mL薯蕷皂苷元、0.584 5 mg/mL5-羥甲基糠醛、0.003 2 mg/mL香草酸、0.012 5 mg/mL蘆丁、0.010 2 mg/mL槲皮素及0.010 6 mg/mL山柰酚的混合標準對照品溶液；分別用80%甲醇將該混合對照品溶液稀釋2、5、8、10及50倍，制成5個質量濃度的系列對照品溶液。各溶液均于4℃冰箱保存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 （1）黃精藥材供試品溶液：根莖去除根須，洗凈，于40℃烘箱烘干，粉碎過50目篩，置于干燥器中。取黃精藥材粉末約1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇30 mL，稱定質量，超聲（功率：200 W，頻率：53 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。（2）黃精飲片供試品溶液：制備方法同黃精藥材。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～8 min，13%A；8～13 min，13%～19%；13～30 min，19%～25%A；30～45 min，25%～50%A；45～50 min，50%～60%A；50～60 min，60%～70%A；60～62 min，70%～90%A；62～65 min，90%～100%A；70～75 min，13%A）；檢測波長5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚為254 nm（0～60 min），薯蕷皂苷元為202 nm（60～75 min）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。取“2.1.1”項下混合對照品溶液和“2.1.2”項下供試品溶液，按此色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各成分與相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按香草酸峰計大于5 000，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.4 線性關系與檢測限、定量限考察 分別吸取“2.1.1”項下制成的5個質量濃度的系列對照品溶液各10 μL，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。每個質量濃度進樣3次，取平均值，以進樣質量（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，并求得信噪比（S/N）分別為3和10的對照品濃度，即為該對照品的檢測限（S/N＝3）和定量限（S/N＝10）。結果表明，各組分在進樣質量濃度范圍內與其峰面積均呈良好的線性關系，結果見表1。

2.1.5 精密度試驗 取同一混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚峰面積的RSD分別為1.2%、2.3%、1.9%、0.8%、2.5%和1.9%（n＝6），說明儀器精密度良好。

表1 6種成分的線性關系及檢測限、定量限考察結果（n＝3）Tab 1 Linear relationship，detection limit and limit of quantitation of 6 components（n＝3）

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份黃精藥材供試品（批號：20181201）溶液，分別在放置0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h時按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，溶液中薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚峰面積的RSD分別為1.9%、2.8%、0.7%、1.6%、0.7%和2.3%（n＝11），表明制備后的供試品溶液在72 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 稱取同一份黃精藥材供試品（批號：20181201）粉末約1.0 g，共6份，按照“2.1.2（1）”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算各成分含量。結果顯示，6份樣品中薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚含量的RSD分別為1.5%、0.9%、2.1%、0.5%、1.2%和1.9%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的黃精藥材（批號：20181201）粉末共9份，每3份為1組，各約0.50 g，精密稱定，分別按已知含量的80%、100%、120%精密加入薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚對照品，然后按“2.1.2（1）”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚的平均回收率分別為99.8%、100.9%、101.1%、101.1%、99.9%和100.1%，RSD分別為 0.3%、2.4%、1.0%、1.4%、1.9%和1.7%（n＝9），表明本方法具有較好的準確度，結果見表2。

2.2QAMS質量評價模式的建立

2.2.1 待測指標RCFs的計算 本研究比較了不同計算方法（斜率法、多點校正法）得到的RCFs。根據(jù)文獻方法[20]，以香草酸為內參物計算其他5個成分的RCFs：RCFs＝（Wk×Am）/（Wm×Ak），其中，Ak為內參物峰面積，Wk為內標物質量，Am為待測組分m峰面積，Wm為待測組分m質量。

表2 回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery tests

斜率法即采用不同質量濃度的混合對照品溶液進樣相同體積測定，記錄峰面積與進樣量，并計算RCFs，分別取“2.1.1”項下制備的5個系列對照品溶液（即“2.1.4”項下線性范圍數(shù)據(jù)），每份樣品平行測定3次，根據(jù)各樣品的平均值計算各成分的平均RCFs值。多點校正法即采取同一質量混合對照品進樣不同體積測定，記錄峰面積與進樣量并計算RCFs，取“2.1.2”項下混合對照品溶液，分別進樣2、4、6、8、10 μL，平行測定3次。本研究結果顯示，斜率法得到的RCFs的相對偏差較多點校正法小，故采用斜率法進行RCFs計算，結果見表3。

表3 不同計算方法的RCFs值比較（n＝3）Tab 3 Comparison of RCFs calculated by different methods（n＝3）

2.2.2 RCFs的耐用性考察 取黃精藥材樣品（批號：20181201）按“2.1.2（1）”項下制備供試品溶液，在不同色譜條件進樣分析，記錄峰面積及各成分含量，并以香草酸為內參物，按公式計算各成分的RCFs值，考察不同色譜條件對RCFs值的影響：（1）采用Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)，考察3種色譜柱[Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]對RCFs值的影響，結果薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、蘆丁、槲皮素及山柰酚RCFs值的RSD均＜1.8%（n＝3），表明RCFs在不同色譜柱具有較好的適應性。（2）采用Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用考察3種不同品牌儀器（Agilent 1100、Waters 2996和島津2010A）對RCFs值的影響，結果薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、蘆丁、槲皮素及山柰酚RCFs值的RSD均＜7.1%（n＝3），表明在使用不同品牌儀器時需要進行波長校正，以獲得更穩(wěn)定的RCFs值。（3）采用Agilent 1100型色譜儀，Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察柱溫分別為20、25、30 ℃時對RCFs值的影響，結果RCFs的RSD＜1.5%（n＝3），表明在不同柱溫下耐用性良好。（4）考察流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min時對RCFs值的影響，結果RCFs的RSD＜2.1%（n＝3），表明在不同體積流量時具有良好的耐用性。

2.3 待測組分色譜峰的定位

采用相對保留法RTRi/Rx＝tRi/tRx，ΔtRi-Rx＝tRi－tRx（RTRi/Rx表示待測成分Ri與內參物Rx的相對保留時間，ΔtRi-Rx表示待測成分Ri與內參物Rx的保留時間差，tRi表示待測成分Ri的保留時間，tRx表示內參物Rx的保留時間）。采用RCFs計算和耐用性考察時記錄的色譜圖，即測定相對保留值在不同品牌儀器、不同色譜柱、不同柱溫和流速時的重現(xiàn)性，計算5種成分的RTRi/Rx和ΔtRi-Rx。結果表明，待測成分間的RTRi/Rx較穩(wěn)定，RSD＜2.0%（n＝3）；但待測成分間的ΔtRi-Rx波動較大。因此，該方法的RTRi/Rx適宜于薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、蘆丁、槲皮素及山柰酚色譜峰的定位，結果見表4、表5。

表4不同品牌儀器和色譜柱下待測成分間的RTRi/Rx和ΔtRi-Rx（n＝3）Tab 4 RTRi/Rxand ΔtRi-Rxamong the components to be determined by using different brand instruments and columns（n＝3）

2.4 黃精藥材QAMS法和外標法測定結果的比較

分別取各批次黃精藥材按“2.1.2（1）”項下制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定。分別采用外標法和建立的QAMS法測定黃精藥材中6種成分含量。結果表明，外標法和QAMS法測得的各成分含量值的相似度均大于0.9；相對偏差[（外標法－QAMS法）/QAMS法×100%]的RSD值均小于5%（n＝3）。應用統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，結果顯示，2種方法測定下6種成分含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結果見表6。

2.5 黃精飲片含量測定方法再驗證

本研究以黃精飲片中香草酸為內參物，采用建立的RCFs值計算飲片中其余5種成分的含量，并同時用外標法測定各成分含量進行結果驗證。采用統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0對兩組間數(shù)據(jù)進行t檢驗分析。結果顯示，采用外標法和QAMS法測定的黃精飲片中薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、香草酸、蘆丁、槲皮素及山柰酚含量的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結果見表7。

表5不同柱溫和流速下待測成分間的RTRi/Rx和ΔtRi-Rx（n＝3）Tab 5 RTRi/Rxand ΔtRi-Rxamong the components to be determined by under different column temperatures and flow rates（n＝3）

表6 2種方法測定黃精藥材中6種成分的含量（%%）Tab 6 Content of 6 components in Polygonati Rhizoma determined by two methods（%%）

表7 2種方法測定黃精飲片中6種成分的含量（%%）Tab 7 Contents of 6 components in Polygonati Rhizoma decoction piece determined by 2 methods（%%）

3 討論

在樣品前處理方法上，根據(jù)待測成分的性質，本研究對不同提取溶劑及用量（甲醇、乙醇、無水乙醇等）、提取方法（超聲、回流提取等）以及提取時間等分別進行了考察，結果表明以50%乙醇為提取溶劑，超聲提取30 min測得的6種成分含量較高。在檢測條件優(yōu)化上，本研究比較了不同的流動相檢測體系（甲醇-醋酸、乙腈-水和乙腈-0.03%磷酸），發(fā)現(xiàn)乙腈-水體系經梯度洗脫后所得各峰分離效果最佳，且配比簡單。在檢測波長的選擇上，本研究采用DAD檢測器，通過在線紫外吸收光譜對6種化學成分進行全波長掃描，最終確定檢測波長（0～60 min，λ1＝254 nm；60～65 min，λ2＝202 nm）可兼顧6種化學成分的最大吸收。

本研究首次將QAMS法結合HPLC雙波長法應用到黃精中酚酸類、皂苷類、黃酮類及醛類成分的多指標質量評價上，避免對照品不穩(wěn)定、價格高等因素，選用價格低廉、性質穩(wěn)定的香草酸為內參物。色譜峰的準確定位及RCFs值的確定是QAMS應用的關鍵。本研究采用相對保留時間結合色譜峰的全波長紫外吸收光譜對未知樣品中待測色譜峰進行了準確定位。在對RCFs考察上，以香草酸為內參物，建立的薯蕷皂苷元、5-羥甲基糠醛、蘆丁、槲皮素及山柰酚的RCFs具有較好的可信度，同時證實在對照品缺乏的條件下，其他成分均可為內參物。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，不同黃精飲片批次間6種成分含量的差異較大，其中5-羥甲基糠醛含量最高，而在黃精藥材中卻多未檢測到或含量極少，表明其可能在炮制工藝過程中產生，這為本課題組進一步探討黃精炮制機制提供了數(shù)據(jù)基礎。同時，不同來源和炮制工藝對黃精飲片化學成分具有較大影響，可為黃精資源開發(fā)及栽培種植提供參考。同時也提示，對黃精藥材和炮制工藝生產過程的質量控制急需加強，以實現(xiàn)終產品的一致性和穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究成功將建立的黃精中不同類成分的QAMS質量評價模式應用于黃精藥材及飲片的質量評價中，實現(xiàn)了中藥藥材、飲片統(tǒng)一的多指標質量評價模式。通過建立黃精及飲片中6種成分的QAMS法，并比較其與外標法測定結果的差異，結果表明在線性范圍內，本研究建立的QAMS法對黃精藥材和飲片具有通用性，準確性高、可行性好，可為其他中藥及相關產品質量控制提供方法參考。