草還丹、人參固本丸和二至丸對D-半乳糖致衰老模型小鼠抗衰老作用的研究

方 哲 陳素紅 方 慧 蘇 潔 呂圭源

衰老是機(jī)體內(nèi)器官及生理機(jī)能逐漸衰退，功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)。隨著老年人口不斷增長，人口老齡化問題已成為國際社會面臨的嚴(yán)峻問題[1]。中醫(yī)在對抗衰老中藥研究中，總結(jié)出許多延緩衰老的方劑和制劑，據(jù)《圣濟(jì)總錄》、《壽親養(yǎng)老新書》等記載，草還丹、人參固本丸和二至丸是由多味味甘，入肝、腎經(jīng)中藥組成的復(fù)方制劑，具有補(bǔ)益肝腎、固本延年之功效。有報道表明，二至丸水煎劑具有一定的抗衰老作用[2-4]，但較少對多臟器進(jìn)行相關(guān)研究。草還丹和人參固本丸的抗衰老作用的現(xiàn)代藥理研究的文獻(xiàn)較少，亦無其他學(xué)者報道關(guān)于多種中藥復(fù)方的抗衰老作用規(guī)律。本研究通過觀察草還丹、人參固本丸和二至丸三種中藥復(fù)方水煎劑對衰老小鼠體征、自主活動、學(xué)習(xí)記憶能力、抓力、骨強(qiáng)度、血脂、性腺系數(shù)的影響，探討抗衰老作用規(guī)律。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康ICR小鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20g，雌雄各半由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物供應(yīng)中心提供[合格證號 SCXK（浙）2008-0033]。常規(guī)飼喂，自由進(jìn)食、飲水，期間保持通氣良好，溫度21～26℃，濕度50%～70%。

1.2 藥物與試劑 本實驗所用二至丸（女貞子、旱蓮草各80g）、草還丹（菊花、巴戟天、枸杞子、肉蓯蓉各40g）和人參固本丸（天冬、麥冬、熟地黃、生地黃各40g，人參20g）所需中藥飲片均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，并由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所制備成含生藥量為0.45g/mL的藥液[5]。D-半乳糖（上海恒信化學(xué)試劑有限公司，批號20090106，用滅菌的生理鹽水配成濃度為10mg/mL注射液）；維生素E軟膠囊（杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新五豐藥業(yè)有限公司，批號080402，置于蒸餾水中，用吐溫-80助溶，超聲振蕩配成濃度為3.5mg/mL的乳白色混懸液）；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（批號 ZGM09132）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號 P090611）、膽固醇（TC）試劑盒（批號 P090321）、葡萄糖（GLU-OX）試劑盒（批號P090441）均購于上海復(fù)興長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.3 儀 器 SELECTRA-E全自動生化儀：荷蘭威圖公司；YSL-13A大小鼠抓力測定儀、YLS-1多功能小鼠自主活動記錄儀、YLS-16A小動物骨骼強(qiáng)度測定儀：山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 72只ICR小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、草還丹組、人參固本丸組、二至丸組和維生素E組，每組12只（雌雄各半）。正常對照組頸背部皮下注射生理鹽水，其余各組按100mg·kg-1·d-1劑量頸背部皮下注射D-半乳糖[6]，造模同時，陽性對照組按50mg/kg劑量灌胃給予維生素E[7]，各中藥復(fù)方組給藥劑量按文獻(xiàn)[4]中給藥劑量經(jīng)實驗動物“等效劑量”的計算方法計算。各復(fù)方組以4.5g·kg-1·d-1劑量灌胃給藥，正常對照組和模型對照給予等體積蒸餾水，連續(xù)42天，每3天稱重1次。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測 （1）水迷宮：造模給藥第37d進(jìn)行小鼠水迷宮實驗評價小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。Morris水迷宮中注入清水，使水面高出站臺表面0.5cm。水溫控制在（22±0.5）℃，在水池上標(biāo)定相同一點作為每次實驗小鼠的入水點。站臺置于離入水點較遠(yuǎn)的象限中間，實驗過程保持站臺位置不變。每次實驗以120s為限，記錄小鼠從入水點到達(dá)站臺所需時間以及在這段時間內(nèi)的游泳路程和速度，以所需時間作為學(xué)習(xí)和記憶成績，若設(shè)定時間內(nèi)未找到站臺，則以120s記。正式測定前，以相同方式適應(yīng)性預(yù)實驗1周。（2）自主活動：造模給藥第38天測小鼠自主活動評價小鼠活躍程度。將小鼠置于自主活動儀內(nèi)預(yù)適應(yīng)5min后，記錄實驗動物在10min內(nèi)活動次數(shù)。（3）抓力及骨強(qiáng)度：造模給藥第40天測小鼠抓力。持抓小鼠尾根處，置于抓力板上進(jìn)行測定，測定兩次取平均值。末次給藥后，取小鼠后肢大腿骨，剔除附著肌肉與韌帶，將骨骼置于骨骼強(qiáng)度測定儀內(nèi)，骨骼受到最大壓力斷裂，讀取骨強(qiáng)度數(shù)值。（4）血生化指標(biāo)：末次給藥后禁食24h，眼眶取血，室溫靜置2h后，3000r/min離心10min分離血清。測定GLU-OX、TC、TG、HDL-C。根據(jù)公式計算：LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2。（5）臟器系數(shù)：將小鼠解剖，取睪丸、精囊腺，計算系數(shù)（系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量×100）。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般狀況觀察 正常對照組小鼠毛色光亮、毛發(fā)濃密，喜動而不喜臥，皮膚彈性良好。模型對照組小鼠毛色蠟黃，皮膚松馳，彈性下降，四肢疲軟無力，行動遲緩，喜蜷縮而不喜動。三個復(fù)方組在實驗前期（給藥第1～3周）出現(xiàn)與模型組小鼠相同體征，但在后期（給藥第4～6周）逐漸恢復(fù)正常。提示可能是三個復(fù)方均入腎經(jīng)，腎其華在發(fā)，甘補(bǔ)可緩解衰老引起的毛發(fā)萎黃，精神萎靡癥狀。

3.2 各組小鼠自主活動、抓力及懸尾時間比較 與正常對照組比較，模型組自主活動、抓力、骨強(qiáng)度明顯下降（P＜0.05）。與模型組比較，各組均能提高衰老小鼠抓力、骨強(qiáng)度；草還丹和人參固本丸可提高自主活動次數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），見表 1。

表1 各組小鼠自主活動、抓力、骨強(qiáng)度比較

表1 各組小鼠自主活動、抓力、骨強(qiáng)度比較

注：“-”無劑量；與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組草還丹組人參固本丸組二至丸組維生素E組劑量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠數(shù)12 12 12 12 12 12自主（次數(shù)）381.08±53.66 346.58±41.06*405.75±62.17△△381.17±50.40△379.45±52.85 412.42±65.58△△抓力（g）173.92±35.32 154.48±13.15*189.52±55.50△184.26±29.57△△173.98±29.53△187.63±62.42△骨強(qiáng)度（kg）1.85±0.34 1.60±0.22*1.96±0.41△△1.84±0.34△1.82±0.30△2.03±0.59△

3.3 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 與正常對照組比較，模型對照組持續(xù)時間、總路程明顯延長（P＜0.05），在第一、四象限持續(xù)時間顯著延長（P＜0.05）；與模型組比較，各復(fù)方組可不同程度減少持續(xù)時間、總路程及在各象限中持續(xù)時間（P＜0.05，P＜0.01），見表2-3。

表2 各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果比較

表2 各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果比較

注：“-”無劑量；與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組草還丹組人參固本丸組二至丸組維生素E組劑量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠數(shù)12 12 12 12 12 12持續(xù)時間（s）32.65±25.90 57.60±32.32*25.75±16.45△△29.82±16.52△△20.18±10.29△△30.80±18.98△總路程（cm）486.04±377.76 816.63±465.42*397.11±235.31△△399.70±206.51△△268.69±99.85△△449.55±296.27△

3.4 各組小鼠血糖、血脂水平比較 與正常對照組比較，模型組血清GLU-OX、TC、TG及LDL-C 明顯升高，HDL-C 明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，三個中藥復(fù)方組可明顯降低TG、TC及LDL-C，升高HDL-C（P＜0.05，P＜0.01）；草還丹和人參固本丸可降低 GLU-OX（P＜0.05，P＜0.01），見表 4。

3.5 各組小鼠睪丸、精囊腺系數(shù)比較 與正常對照組比較，模型組睪丸系數(shù)和精囊腺系數(shù)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，人參固本丸組、二至丸組能提高睪丸系數(shù)（P＜0.05）；草還丹組和人參固本丸組能提高精囊腺系數(shù)（P＜0.05），見表 5。

4討 論

中醫(yī)認(rèn)為，臟腑虛衰是導(dǎo)致衰老、死亡的原因，其中肝腎虛衰與衰老關(guān)系密切，腎虛為主、血瘀為輔是導(dǎo)致衰老的原因，疏肝益腎可延緩衰老[8]。草還丹以味甘性溫、補(bǔ)腎助陽巴戟天為君藥，輔以味甘溫陽肉蓯蓉和枸杞，具有溫補(bǔ)肝腎，益氣壯骨，固本延年之功效；人參固本丸按天（天門冬）、地（生地黃、熟地黃）、人（人參）配置，諸藥味甘補(bǔ)益，共奏補(bǔ)血益氣，生精固本，延年益壽之藥效。二至丸以性涼的女貞子為君藥，臣以性涼的墨旱蓮，補(bǔ)益肝腎，滋陰止血。已有報道提示二至丸具有一定的抗衰老作用[2-5]。

表3 各組小鼠水迷宮實驗結(jié)果比較

注：“-”無劑量；與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組草還丹組人參固本丸組二至丸組維生素E組劑量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05第一象限時間6.74±7.15 15.60±11.23*6.68±5.90△7.76±5.88△3.49±2.99△△8.13±6.09△第二象限時間8.25±6.53 13.51±9.32 4.99±2.64△△9.85±6.04 6.02±3.78△7.49±5.13△第三象限時間8.66±6.23 12.66±7.06 4.88±4.28△△6.56±4.98△4.83±2.75△△5.76±5.29△△第四象限時間8.59±7.74 15.84±8.63*9.20±6.04△5.65±4.03△△5.84±4.52△△9.42±6.32△鼠數(shù)12 12 12 12 12 12

表4 各組小鼠血糖、血脂比較（mmo/L

表4 各組小鼠血糖、血脂比較（mmo/L

注：“-”無劑量；與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；GLU-OX：葡萄糖；TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

組別正常對照組模型組草還丹組人參固本丸組二至丸組維生素E組劑量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 GLU-OX 3.68±0.90 4.48±0.63*3.10±0.86△△3.38±0.96△△3.93±1.05 3.87±1.03 TG 0.96±0.34 1.26±0.25*1.03±0.21△1.04±0.25△1.07±0.19△0.98±0.29△TC 2.19±0.72 2.86±0.74*2.27±0.59△2.25±0.53△2.42±0.32△2.77±0.98 HDL-C 0.86±0.14 0.76±0.11*0.92±0.19△0.86±0.16△0.92±0.14△△0.94±0.26△LDL-C 0.89±0.63 1.52±0.77*0.86±0.54△0.91±0.44△1.02±0.26△1.39±0.79

表5 各組小鼠睪丸、精囊腺系數(shù)比較（%

表5 各組小鼠睪丸、精囊腺系數(shù)比較（%

注：“-”無劑量；與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別正常對照組模型對照組草還丹組人參固本丸組二至丸組維生素E組劑量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠數(shù)666666睪丸系數(shù)0.826±0.077 0.679±0.042**0.735±0.080 0.810±0.112△0.754±0.087△0.771±0.094△精囊腺系數(shù)0.538±0.130 0.416±0.085*0.570±0.156△0.548±0.138△0.473±0.153 0.560±0.140△

D-半乳糖能使細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，進(jìn)而生成不能被細(xì)胞代謝的半乳糖醇，以致細(xì)胞損傷、代謝紊亂，使多器官功能減退，最終導(dǎo)致衰老[9]。研究表明，D-半乳糖所致衰老模型在抗衰老研究中應(yīng)用廣泛，具有衰老變化明顯，癥狀全面，模型穩(wěn)定等特征[10]。

本研究結(jié)果顯示，三個中藥復(fù)方能提高小鼠抓力、骨強(qiáng)度，這些作用可能與三種中藥復(fù)方入肝腎經(jīng)有關(guān)，肝主筋、腎主骨，發(fā)揮補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋健骨之作用從而改善衰老導(dǎo)致的腎虛之腰膝酸軟。草還丹和人參固本丸能提高自主活動次數(shù)，改善精神萎靡癥狀，二至丸效果不顯著，可能與二至丸性涼，草還丹與人參固本丸性溫有關(guān)，需進(jìn)一步研究。衰老可導(dǎo)致健忘，思維敏捷性降低，學(xué)習(xí)能力下降等。實驗結(jié)果表明，給予中藥復(fù)方治療后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。這可能是腎與心關(guān)系密切，體現(xiàn)在水火既濟(jì)以及君火相火，所以心火可防止腎水過寒，同時制約相火[11]。脂質(zhì)代謝的能力及氧自由基清除能力隨機(jī)體的老化而退化，血液內(nèi)脂類物質(zhì)堆積，誘發(fā)多種疾病的發(fā)生及重要器官的衰老，高血脂等因素與衰老常互為因果，相互促進(jìn)[12]。實驗結(jié)果表明，D-半乳糖致衰老小鼠血清GLU-OX、TC、TG及LDL-C含量明顯升高，HDL-C含量則明顯下降，這與自然衰老時血脂的變化相同。三個中藥復(fù)方組能不同程度的改善血脂異常情況。這可能與之“入肝腎，肝主疏泄，主藏血，調(diào)暢氣機(jī)之功”有關(guān)。

實驗動物的臟器系數(shù)是藥物非臨床研究中重要的參考指標(biāo)[13]，臟器系數(shù)可以反映器官的結(jié)構(gòu)變化，也間接說明臟器本身的功能。有研究表明，D-半乳糖可誘導(dǎo)生殖功能退化[11]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過D-半乳糖注射后，雄性大鼠的睪丸、精囊腺系數(shù)降低，表明器官出現(xiàn)老化、功能下降，加速了小鼠衰老；三個中藥復(fù)方組能不同程度的改善衰老小鼠睪丸、精囊腺系數(shù)。

綜上所述，草還丹、人參固本丸和二至丸可通過改善衰老所致精神萎靡、強(qiáng)筋健骨、增強(qiáng)記憶學(xué)習(xí)能力及提高性腺指數(shù)等癥狀起到延緩衰老作用，該作用可認(rèn)為是這三種中藥復(fù)方抗衰老藥效的共同規(guī)律，二至丸與草還丹、人參固本丸的作用略有差異，可能與二至丸“性涼”而草還丹、人參固本丸“性溫”有關(guān)，但需進(jìn)一步研究。