右歸飲對輕微中樞神經(jīng)損傷模型大鼠海馬組織細胞自噬表達的影響

鄒 陽 王昌興

輕微中樞神經(jīng)損傷是由交通車禍、體育運動等造成的腦、脊髓輕度挫傷。雖然中樞神經(jīng)輕微傷的嚴重程度較其他的閉合性神經(jīng)損傷要輕，但仍會引起細胞變性和凋亡，逐步影響患者認知和運動協(xié)調(diào)能力[1]。由于病理機制尚未明確，且神經(jīng)細胞再生能力較差，故缺乏有效的治療手段。輕微中樞神經(jīng)損傷屬中醫(yī)“神志病”范疇，辨證為腎陽虧虛。故治療宜溫陽補腎，填精益髓。研究證實，右歸飲可以抑制神經(jīng)細胞的凋亡[2]。本研究觀察右歸飲對輕微中樞神經(jīng)損傷模型大鼠海馬組織細胞自噬相關基因和蛋白的表達，及海馬組織細胞形態(tài)改變的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 雄性Sprague Dawley大鼠48只，清潔級，4周齡，初始體質(zhì)量85～95g。所有大鼠購自中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司（動物生產(chǎn)合格證：SCXK（滬）2012-0002），大鼠的飼養(yǎng)與實驗操作均于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心完成（動物實驗使用許可證：SYXK（浙）2013-0184）。

1.2 藥 物 實驗用中藥購自浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院名中醫(yī)分館，并于中藥室內(nèi)制備。根據(jù)《景岳全書》，方劑右歸飲由熟地黃9g，山藥6g，山茱萸、肉桂各3g，制附子9g，姜杜仲、枸杞各6g，炙甘草3g組成，通過濃縮、干燥后制成細粉，并溶解于生理鹽水中至0.69g/mL備用。

1.3 試劑及儀器 抗Beclin-1抗體購自北京博奧森公司（兔抗，批號AF07044415）；抗mTOR抗體購自北京博奧森公司（兔抗，批號AF12262669）；抗LC3抗體購自北京博奧森公司（兔抗，批號AF10285813）；超敏酶標羊抗兔抗體來自于北京中杉生物公司（批號107257D9）；熒光羊抗兔抗體來自美國LI-COR公司（批號C51104-08）；RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司（批號AK1401）；SYBR Premix Ex TaqTMII購自 TaKaRa公司（批號 AKA1201）；PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司（批號AK5101）。AP280-2包埋機、HM335E切片機來自德國MICROM公司；Nikon Eclipse 80i顯微鏡來自日本Nikon公司；Carl Zeiss Imaging系統(tǒng)軟件來自德國Carl Zeiss公司；HVP-50高壓滅菌器來自日本HIRAYAMA公司；吸入麻醉機來自深圳瑞沃德公司；DRP-9052電熱恒溫箱來自上海森信公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模與給藥 采用隨機數(shù)字表法隨機將48只SD大鼠分為損傷模型組、右歸飲組和空白對照組，每組16只。按照Richelle Mychasiuk[3]提出的改良重物自由落體法進行造模：將損傷模型組與治療組的大鼠置于吸入麻醉機中，吸入異氟烷（1%～2%in air/O2 mix）約 3min。當大鼠結(jié)膜反射消失、確認輕度麻醉后，將大鼠俯臥于錫箔紙平臺上，下方放置海綿墊保護。另將一150g重量的砝碼通過釣魚線與鐵架臺拴住后，置于柱狀聚乙烯管（直徑2cm，長1.5m）中。將聚乙烯管置于大鼠頭部上方，用插銷固定砝碼于大鼠頭部中心上方0.5m處。撤去插銷后，砝碼自由落下，直接砸中麻醉下的大鼠頭部正中處，大鼠便會跌落到海綿墊中，而砝碼被釣魚線系在海綿墊上方不繼續(xù)下落，避免二次傷害。持續(xù)造模3天，每天1次。而空白對照組大鼠則不做任何處理。造模結(jié)束后對大鼠進行行為學分析，確定造模成功后，對大鼠進行給藥，具體如下：根據(jù)成人日用臨床劑量和前期研究結(jié)果，實驗灌胃時將右歸飲濃縮至最適濃度，對右歸飲組大鼠以10g/kg體質(zhì)量的劑量進行右歸飲灌胃治療，同時以等量的生理鹽水對模型組和空白對照組大鼠進行灌胃，每天1次，共灌胃4周。

2.2 標本和檢測指標 灌胃結(jié)束后，麻醉所有大鼠，取出大鼠的大腦組織，將每組8只大鼠的大腦進行石蠟包埋。再將每組剩余8只大鼠大腦的海馬組織分離出，置于-80°C中保存。對石蠟包埋的標本進行HE染色和免疫組化檢測，在光學顯微鏡下觀察海馬組織的病理變化和自噬指標mTOR:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1基因編碼蛋白（Beclin-1）、微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）的蛋白表達情況。冰凍海馬組織蛋白則進行實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（QPCR）檢測（TaKaRa公司RNA提取試劑說明書，提取大鼠海馬組織后的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，并測定mRNA的表達量），觀察自噬指標mTOR、Beclin-1、LC3基因表達變化。引物序列見表1。

表1 Beclin-1、LC3、mTOR和 β-Actin引物

2.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)標準差表示計量資料。對于屬于正態(tài)分布的三組數(shù)據(jù)應用單因素方差分析比較，并進行兩兩比較的q檢驗，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 海馬組織標本病理學觀察 損傷模型組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞數(shù)目稀少，排列紊亂，較多細胞核碎裂，細胞邊緣較為模糊。右歸飲組大鼠海馬組織細胞數(shù)目較損傷模型組多，排列較均勻，細胞邊緣欠清晰?？瞻讓φ战M大鼠海馬組織細胞排列均勻，邊緣清晰，細胞核形態(tài)規(guī)則，胞外基質(zhì)為粉紅色，胞核為深藍色（見插頁圖1）。

3.2 大鼠海馬組織自噬蛋白表達變化 與空白對照組和損傷模型組比較，右歸飲組大鼠自噬相關蛋白Beclin-1、LC3表達的陽性指數(shù)顯著增高，mTOR表達則降低（P＜0.01，P＜0.05），空白對照組與損傷模型組之間的蛋白表達的陽性指數(shù)則無明顯差異（P＞0.05）。見表 2，插頁圖 2-4。

表2 各組大鼠海馬組織蛋白表達陽性指數(shù)比較

表2 各組大鼠海馬組織蛋白表達陽性指數(shù)比較

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與損傷模型組比較，△P＜0.01；Beclin-1：BECN-1基因編碼蛋白；LC3：微管相關蛋白 1輕鏈 3；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

組別損傷模型組右歸飲組空白對照組鼠數(shù)888 Beclin-1 0.05±0.05 0.11±0.04**△0.05±0.01 LC3 0.01±0.00 0.03±0.02**△0.01±0.01 mTOR 0.09±0.04 0.03±0.03*△0.08±0.04

3.3 QPCR檢測大鼠海馬組織自噬相關基因表達水平 與空白對照組和損傷模型組比較，右歸飲組大鼠海馬組織中自噬相關蛋白Beclin-1、LC3表達含量顯著增高（P＜0.01），mTOR 顯著降低（P＜0.01），而空白對照組與損傷模型組之間的蛋白表達量則無明顯差異（P＞0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠海馬組織自噬基因mRNA表達比較

表3 各組大鼠海馬組織自噬基因mRNA表達比較

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與損傷模型組比較，△P＜0.01；Beclin-1：BECN-1基因編碼蛋白；LC3：微管相關蛋白1輕鏈3；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

組別損傷模型組右歸飲組空白對照組鼠數(shù)888 Beclin-1 0.34±0.11 1.06±0.21**△0.43±0.36 LC3 1.12±0.09 1.75±0.21**△1.01±0.17 mTOR 1.74±0.73 0.91±0.17**△1.62±0.26

4 討論

中醫(yī)認為，腎主志，生髓通腦。腦為髓海，神經(jīng)損傷后腎精不足，腦髓空虛，不能化生氣血濡養(yǎng)肌肉骨骼，所以認知功能不足，小兒發(fā)育遲緩，運動不協(xié)調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，通過對腎虛模型大鼠溫補腎陽，可以發(fā)現(xiàn)血漿和腦組織EPO表達含量增加，降低細胞的凋亡[2]。腎中精氣可化髓充腦，故補腎益精健腦，用于治療中樞神經(jīng)損傷。右歸飲作為補腎溫陽的代表方，溫補腎陽為主，而陰陽兼顧。研究發(fā)現(xiàn)右歸飲可以保護腎虛模型大鼠損傷的神經(jīng)細胞，升高大鼠大腦皮質(zhì)抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率（Bcl-2/Bax），減少凋亡[2]；在腦脊髓炎軸突損傷的模型中，右歸飲可以防止軸突的再次損傷，并且促進軸突的再生，增加神經(jīng)生長因子的表達[4]。

自噬是真核細胞通過溶酶體機制降解自身成分的一種代謝途徑，與細胞的存活、穩(wěn)態(tài)、分化關系密切。自噬會清除某些毒素、病原體，還有變性的胞漿成分，中止細胞的進一步損傷。但自噬的作用具有兩面性，過度激活自噬可導致細胞死亡，這取決于病變不同階段的環(huán)境變化和治療干預的不同[5]。近年來，自噬在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病中的研究較多[6-8]，但對大腦和脊髓等中樞神經(jīng)損傷后自噬發(fā)生的研究較少，而且中樞神經(jīng)損傷后的治療基本上無實質(zhì)性的突破。自噬主要的調(diào)節(jié)機制有磷酸肌醇三磷酸激酶（phosphatidylinositol kinase-3 kinase，PI3K）、mTOR 和氨基酸、激素等。mTOR途徑是目前研究最多的信號途徑的一種，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病關系密切[9-10]。mTOR是氨基酸和ATP的感受器，當AMP激活性蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）感受胞內(nèi)ATP/AMP比值，進而通過mTOR信號啟動自噬。Beclin-1及LC3則為自噬相關性蛋白，其表達量與自噬的水平呈正相關。

本研究結(jié)果顯示，右歸飲治療后，免疫組化和QPCR的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的海馬組織Beclin-1、LC3的mRNA和蛋白表達量較損傷模型組和空白對照組顯著上調(diào)（P<0.01），而mTOR的mRNA和蛋白表達量較其余兩組則下調(diào)（P<0.01，P<0.05），說明右歸飲通過下調(diào)mTOR，促進神經(jīng)細胞自噬表達上調(diào)。同時，HE染色觀察到右歸飲治療組的海馬組織神經(jīng)細胞數(shù)目較損傷模型組多，總體上排列較均勻，表明右歸飲治療后大腦神經(jīng)細胞的破壞得到有效的緩解。