灘羊微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性及與體尺性狀關(guān)聯(lián)分析

李標(biāo) 張瑞瑩 王小琪 張存芳 段子淵

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所資源研究中心，北京 100101；3. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008）

灘羊是蒙古羊經(jīng)游牧遷徙至寧夏境內(nèi)，于黃河兩岸草灘世代繁育形成的優(yōu)良裘皮與肉用羊［1]，是我國(guó)特有的地方綿羊品種，屬國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)羊種之一?，F(xiàn)主要分布于寧夏以及毗鄰的甘肅、內(nèi)蒙古、陜西等部分地區(qū)［2]。灘羊肉富含人體所需的脂肪酸、維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分以及鐵、磷、鉀等礦物質(zhì)［3-4]，風(fēng)味氨基酸含量高，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美。與我國(guó)地方羊品種類似，灘羊存在生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、繁殖率低（1年平均胎產(chǎn)羔率102%）、尾脂和內(nèi)脂沉積較多等缺點(diǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益較低［1，3，5]。因此，需要利用各類先進(jìn)的技術(shù)手段保持灘羊的特色性狀，同時(shí)克服其自身缺點(diǎn)。開(kāi)展對(duì)基礎(chǔ)母羊群體的深入了解則是開(kāi)展有計(jì)劃改良的前提。

在眾多對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的技術(shù)手段中，廣布于基因組的微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite 或Simple sequence repeats，SSR）能提供豐富的多態(tài)位點(diǎn)，易于檢測(cè)、分析方便［6]，是快速了解群體遺傳背景的有效而經(jīng)濟(jì)的手段［7-9]。例如，陳仁金等通過(guò)10個(gè)高多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)分析寧夏白色灘羊與黑色灘羊群體，發(fā)現(xiàn)它們之間存在一定的遺傳分化［10]，但湯曉良通過(guò)10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析灘羊群體內(nèi)部遺傳變異和親緣關(guān)系時(shí)卻發(fā)現(xiàn)寧夏白色和黑色灘羊群體間分化程度較低［11]。究其原因主要與取樣時(shí)群體的狀態(tài)和樣本量、使用位點(diǎn)的不統(tǒng)一及其位點(diǎn)信息的多寡有關(guān)。閆路娜等［12]在種群微衛(wèi)星DNA分析中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星分析群體所需樣本量最低應(yīng)大于30才不會(huì)對(duì)各種遺傳多樣性度量指標(biāo)有影響；李鷗等［13]研究認(rèn)為在分析群體遺傳多樣性時(shí)樣本含量應(yīng)大于40，較高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量應(yīng)大于25。顯然，針對(duì)同一品種的基因組信息使用一套數(shù)量較多和多態(tài)信息豐富的標(biāo)記位點(diǎn)將是比較的前提和基礎(chǔ)。

此外，微衛(wèi)星標(biāo)記還用來(lái)檢測(cè)與性狀間的關(guān)聯(lián)而作為分離功能基因的手段之一，被廣泛用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、定位數(shù)量性狀基因座、評(píng)估遺傳多樣性、反應(yīng)品種間的遺傳關(guān)系等。Pei等［14]從71個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出17個(gè)可對(duì)牦牛進(jìn)行親子鑒定；孫業(yè)良等［15]分析微衛(wèi)星標(biāo)記與中國(guó)美利奴羊肉用品系體重的相關(guān)關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)緊密連鎖的基因座OARHH35和BMS648與體重間存在顯著差異（P＜0.05），找到一個(gè)影響體重的數(shù)量性狀座位（Quantitative trait locus，QTL），同時(shí)檢測(cè)出6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與體重呈正相關(guān)。

本研究旨使用篩選的一套適用于灘羊檢測(cè)的29個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，檢測(cè)了寧夏灘羊核心產(chǎn)區(qū)部分基礎(chǔ)母羊的群體遺傳多樣性，分析了上述微衛(wèi)星位點(diǎn)與灘羊8項(xiàng)體尺指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性，旨為灘羊的種質(zhì)資源保護(hù)、群體遺傳改良的輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為從寧夏回族自治區(qū)鹽池縣灘羊種羊場(chǎng)群體中隨機(jī)選擇年齡在1-3歲范圍的灘羊母羊96只。主要擴(kuò)增試劑為南京諾維贊生物科技公司生產(chǎn)的2×Taq Master Mix預(yù)混酶，熒光引物于北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物篩選 通過(guò)文獻(xiàn)查閱和搜尋綿羊相關(guān)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)匯集可用的綿羊微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，以20只左右隨機(jī)選取的小群體灘羊DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。反應(yīng)體系為15 μL，使用 2×Taq Master Mix預(yù)混酶，采用 TP-M13-SSR 技術(shù)［16]，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)添加熒光標(biāo)記，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增（94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min），之后25個(gè)循環(huán)的熒光標(biāo)記PCR（94℃變性40 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min）最后72℃延伸10 min，反應(yīng)完成后4℃保存。對(duì) PCR結(jié)果進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增條帶狀態(tài)和多態(tài)性確定是否入選。

1.2.2 體尺測(cè)量、組織樣本采集與DNA提取 逐一測(cè)量每個(gè)個(gè)體的體重、體尺性狀（體斜長(zhǎng)、體高、薦高、胸圍、胸深、胸寬、腰角寬和管圍），同時(shí)剪取其耳組織樣品，置無(wú)水乙醇中，存放于-20℃冰箱。使用酚-氯仿法提取灘羊每個(gè)個(gè)體的基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)純度及濃度，原液置于-20℃冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存，滅菌去離子水稀釋為20 ng/μL工作液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR位點(diǎn)擴(kuò)增與數(shù)據(jù)分析 對(duì)96個(gè)灘羊個(gè)體DNA樣品按照1.2.1步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，帶型合格的樣品稀釋純化后，送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司用ABI3730 DNA Analyzer分析獲取電泳熒光數(shù)據(jù)。之后用GeneMarker V2.2.0［17]軟件讀取，使用基于Excel的MStools［18]進(jìn)行數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換及統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）。分別用 GENEPOP 1.32［19]分析計(jì)算上述SSR標(biāo)記在群體中的期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）、等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）；用 GenAlex 6.5［20]軟件估算群體的遺傳距離并生成主坐標(biāo)分析圖；STRUCTURE 2.3［21]軟件和在線軟件Structure Harvester（http：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/#）進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析；TASSEL 5.0［21]軟件進(jìn)行性狀的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 灘羊體重、體尺測(cè)定

測(cè)定的96只灘羊基礎(chǔ)母羊的體重與體尺數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性及群體遺傳多樣性檢測(cè)

利用TP-M13-SSR系統(tǒng)和瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得29個(gè)條帶清晰明亮、具有較好多態(tài)性的SSR標(biāo)記，可用于灘羊群體遺傳分析。用此套標(biāo)記檢測(cè)96個(gè)灘羊基礎(chǔ)母羊的群體遺傳背景，結(jié)果（表2）顯示，該群體的等位基因數(shù)為4-22，平均等位基因數(shù)9.5；有效等位基因數(shù)1.7-9.6，平均有效等位基因數(shù)4.5；期望雜合度0.41-0.90，平均期望雜合度0.72；觀測(cè)雜合度為0.22-0.93，平均觀測(cè)雜合度0.64；多態(tài)信息含量0.38-0.89，平均多態(tài)信息含量0.69，屬于多樣性較高的群體。

2.3 灘羊群體遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)

用遺傳距離矩陣進(jìn)行96個(gè)個(gè)體的主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果見(jiàn)圖1。圖中顯示該基礎(chǔ)母羊群個(gè)體間遺傳距離分布較為均勻，不存在明顯的分化。利用STRUCTURE軟件基于群體基因型分布頻率進(jìn)行的群體結(jié)構(gòu)估算顯示，本實(shí)驗(yàn)所抽樣的群體內(nèi)遺傳背景來(lái)源豐富，具有一定的多樣性，并根據(jù)在線軟件Structure Harvester計(jì)算出：當(dāng)K=3時(shí)，ΔK值最大，灘羊基礎(chǔ)母羊群體結(jié)構(gòu)最佳（圖1和圖2）。

2.4 微衛(wèi)星標(biāo)記與體尺的關(guān)聯(lián)

灘羊微衛(wèi)星標(biāo)記與基礎(chǔ)母羊體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，MAF33與體高、胸深存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05）；標(biāo)記BMS1788與薦高、胸圍顯著或極顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05，或P＜0.01）；而管圍與5個(gè)標(biāo)記MAF33、BMS500、BL41、BMS835和BOVILS56均極顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.01）。

3 討論

本研究對(duì)96只1-3歲成年灘羊種羊場(chǎng)母羊群體的體重和體尺進(jìn)行了測(cè)定，成年母羊的體重為49.20±5.27 kg，與《中國(guó)羊品種志》中灘羊的測(cè)定數(shù)據(jù)［22]和吉帥［23]2013年對(duì)12月齡成年母羊測(cè)定的數(shù)據(jù)（41.58±4.11 kg）相比，體重較大。《中國(guó)羊品種志》數(shù)據(jù)顯示，母灘羊的成年體重一般春季為35 kg，秋季為45 kg，本次測(cè)定的體重?cái)?shù)據(jù)呈現(xiàn)增加態(tài)勢(shì)，一方面說(shuō)明隨著寧夏禁牧舍飼措施的實(shí)施，舍飼狀態(tài)下羊只體重比放牧狀態(tài)有所提高；另一方面也說(shuō)明持續(xù)實(shí)施的保種選育措施在體重性狀的改良上呈現(xiàn)出良好的選擇效應(yīng)，這一結(jié)論也得到錢文熙等和周靜靜等［24-26]研究結(jié)果的支持。

Barker等［27]的研究表明微衛(wèi)星位點(diǎn)最少應(yīng)該有四個(gè)等位基因才可進(jìn)一步利用遺傳參數(shù)進(jìn)行多樣性評(píng)估，本研究所篩選的29個(gè)灘羊微衛(wèi)星位點(diǎn)均具有超過(guò)4個(gè)等位基因，平均有效等位基因數(shù)4.41。從衡量基因片段多態(tài)性的多態(tài)信息含量（PIC）來(lái)看，若微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC＞0.5，該微衛(wèi)星位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)；若0.25＜PIC＜0.5，則該位點(diǎn)是中度多態(tài)性；若PIC＜0.25，則屬于低度多態(tài)性位點(diǎn)［28]。本研究篩選出的位點(diǎn)中，除DU264615、HUJ625、BM2504屬中度多態(tài)性位點(diǎn)外，其他26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均是高度多態(tài)性位點(diǎn)。說(shuō)明該29個(gè)灘羊微衛(wèi)星位點(diǎn)適宜用于灘羊群體的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的正確評(píng)估以及生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析。

圖1 灘羊基礎(chǔ)母羊遺傳距離的主坐標(biāo)（PCoA）分析結(jié)果

圖2 灘羊基礎(chǔ)母群群體ΔK值折線結(jié)果

從對(duì)96個(gè)抽樣個(gè)體的群體檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，29個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)相差較大，群體的平均多態(tài)信息含量值為0.691 8，說(shuō)明該群體遺傳多樣性較為豐富。從廣泛用于度量群體遺傳變異的參數(shù)雜合度來(lái)看，若群體雜合度大于0.5，說(shuō)明該群體未受到較高強(qiáng)度的選擇，有豐富的多樣性；反之，小于0.5，說(shuō)明該群體遺傳多樣性較低［29]。本抽樣群體的平均期望雜合度為0.722 4，平均觀測(cè)雜合度0.643 4，表明該灘羊群體的遺傳變異豐富。湯曉良［11]利用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析寧夏灘羊群體時(shí)測(cè)定的平均期望雜合度是0.801 4-0.814 2，而平均觀測(cè)雜合度是0.269 3-0.300 0，兩者差值相差較大，可能由于各個(gè)種羊場(chǎng)配種種公羊較少或?yàn)楂@得某一性狀而近交導(dǎo)致，他依據(jù)當(dāng)時(shí)灘羊繁育面臨的困難局面，由此得出灘羊品質(zhì)嚴(yán)重退化的結(jié)論，但這也可能與使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量不足和多態(tài)程度不高有關(guān)。2011年，婁淵根［30]用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記測(cè)定的寧夏灘羊平均期望雜合度是0.671 1，平均觀測(cè)雜合度0.492 5。本研究測(cè)定的相應(yīng)值高于湯、婁的結(jié)果，無(wú)論從使用的微衛(wèi)星數(shù)量還是從各位點(diǎn)的多態(tài)程度來(lái)看，應(yīng)更具客觀性。

圖3 灘羊基礎(chǔ)母羊群體STRUCTURE結(jié)果圖

表3 微衛(wèi)星標(biāo)記與灘羊群體體尺性狀關(guān)聯(lián)分析矯正后的P值

通常，由于飼養(yǎng)環(huán)境長(zhǎng)期相對(duì)隔離，對(duì)于小群體羊場(chǎng)或農(nóng)戶則會(huì)造成群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳距離過(guò)小，甚至群體的后代可能出自同一個(gè)家系而長(zhǎng)期近交造成種群衰退［31]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年寧夏鹽池縣建成飼養(yǎng)量大于1 000只的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)317個(gè)，大型養(yǎng)殖園區(qū)23個(gè)［32]，區(qū)內(nèi)每年以補(bǔ)貼機(jī)制低價(jià)調(diào)配供給各養(yǎng)殖場(chǎng)種公羊，避免了各羊場(chǎng)母羊群體內(nèi)家系狹窄而出現(xiàn)的近交現(xiàn)象。本研究基于個(gè)體間遺傳距離得出的主坐標(biāo)分析圖顯示，灘羊基礎(chǔ)母羊群體內(nèi)不存在明顯的遺傳分化；從推斷群體遺傳結(jié)構(gòu)的STRUCTURE直觀分析結(jié)果來(lái)看，當(dāng)K = 3時(shí)，ΔK最大，群體均一但遺傳背景豐富。說(shuō)明該灘羊群體既保持了豐富的遺傳變異，又在很大程度上保持了品種的同質(zhì)性，不會(huì)產(chǎn)生群體性分化而可能導(dǎo)致新的基因群出現(xiàn)［33]。

對(duì)家畜測(cè)量的體尺是生長(zhǎng)性狀的外在表現(xiàn)。本次用微衛(wèi)星進(jìn)行的性狀關(guān)聯(lián)分析共發(fā)現(xiàn)6個(gè)位點(diǎn)MAF33、BMS1788、BMS500、BL41、BMS835 和BOVILS56與生長(zhǎng)性狀間有顯著或極顯著關(guān)聯(lián)。通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中有些在其他綿羊品種或山羊中也存在與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)，如BMS1788 與新疆細(xì)絨山羊的絨毛細(xì)度、長(zhǎng)度和產(chǎn)量相關(guān)［34]；BMS835與中國(guó)美利奴羊羊毛的長(zhǎng)度及細(xì)度相關(guān)［35]；而MAF33 標(biāo)記與眼肌面積、凈肉重相關(guān)聯(lián)［36]。說(shuō)明這些標(biāo)記可能與控制性狀的 QTL 或主基因連鎖［12]。另外，MB116、MB076和BM7109的期望雜合度分別是0.664 1、0.720 0、0.753 2，觀測(cè)雜合度分別是0.276 6、0.234 0、0.215 9，期望雜合度與觀測(cè)雜合度相差較大，說(shuō)明這些位點(diǎn)的等位基因在群體內(nèi)的分布并不均勻，這可能與位點(diǎn)受到選擇作用相關(guān)，提示其與某些性狀的關(guān)聯(lián)性。本研究中，與標(biāo)記位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)中既有一個(gè)標(biāo)記同幾個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)，也有幾個(gè)標(biāo)記同一個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的，看似是位點(diǎn)存在一因多效或多因一效的現(xiàn)象［37]。顯然，無(wú)論是連鎖還是多效關(guān)聯(lián)，均應(yīng)是位點(diǎn)所在的基因片段與實(shí)際控制性狀的基因相關(guān)，或者控制該性狀的基因本身就位于該區(qū)域，直接或參與了該性狀呈現(xiàn)表型的生理過(guò)程，值得后期在大規(guī)模基因組關(guān)聯(lián)分析和功能基因的分離中予以重點(diǎn)關(guān)注。

4 結(jié)論

本研究中，微衛(wèi)星位點(diǎn)DU264615、HUJ625和BM2504是中度多態(tài)性位點(diǎn)，其他26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是高度多態(tài)性位點(diǎn)，而位點(diǎn)MB116、MB076和BM7109 呈現(xiàn)出觀測(cè)雜合度顯著偏離期望雜合度的現(xiàn)象，說(shuō)明這幾個(gè)位點(diǎn)可能與某些性狀相關(guān)聯(lián)；位點(diǎn) MAF33、BMS1788、BMS500、BL41、BMS835 和BOVILS56與生長(zhǎng)性狀間有顯著或極顯著關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步研究。綜合多個(gè)指標(biāo)的群體遺傳背景分析來(lái)看，本試驗(yàn)所抽樣的灘羊群體其遺傳變異豐富，存在較好的多樣性，可供該品種內(nèi)選擇的范圍較廣；保種選育加環(huán)境改善導(dǎo)致基礎(chǔ)母羊體重顯著增大的實(shí)踐也表明，對(duì)該灘羊群體實(shí)施品種內(nèi)提純復(fù)壯的遺傳改良前景良好。所以，建立完善的譜系檔案和交配記錄，定期開(kāi)展群體遺傳距離和遺傳結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)有利于監(jiān)控種群在遺傳水平上的健康情況。