小分子前體物對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

周劍 孫菲 方志鍇 江紅

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007）

巴弗洛霉素（Bafliomycins）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)上極為特殊的多烯16元環(huán)內(nèi)脂類抗生素，其大部分衍生物的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中都含有一個六元環(huán)的半縮醛結(jié)構(gòu)［1-2]。其中巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一種空泡H+-ATP酶（V-ATPase）的特異性抑制劑，能夠抑制自噬體和溶酶體結(jié)合而抑制自噬［3]。V-ATPase廣泛分布于真核生物的液泡，溶酶體，反式高爾基體，分泌顆粒，核內(nèi)體等細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中，根據(jù)細(xì)胞器官的微小酸性差別，各自發(fā)揮獨立機(jī)能，是一種新的藥物靶點［4-5]。另外，巴弗洛霉素類化合物還具有抗細(xì)菌［6]、抗真菌［7]、殺蟲［8]、除草［9]、抗腫瘤［10]以及免疫抑制等多種生物活性［11]。

在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生物合成中，低級脂肪酸、氨基酸、小分子有機(jī)酸/醇等可以作為前體單元構(gòu)成內(nèi)酯環(huán)，但部分前體物不易被菌體合成，因而成為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素生物合成的限制性因素［12]。安絲菌素發(fā)酵過程中添加前體物纈氨酸、異丁醇等均能有效提高主組分安絲菌素P-3含量［13-14]；紅霉素發(fā)酵過程中添加甘氨酸、植物油等也可以促進(jìn)紅霉素產(chǎn)量，使主組分紅霉素A比例提高，降低紅霉素C含量［14，16]；那他霉素生產(chǎn)過程中添加0.6%的丙酸鈉，可以使發(fā)酵效價提高1.8倍［17]。由此可見，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量的前體物質(zhì)，通過發(fā)酵代謝調(diào)控，就有可能縮短其生物合成周期，提高大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵產(chǎn)量。根據(jù)巴弗洛霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點和生物合成途徑［18-19]，本文選取乙酸鈉、丙酸鈉、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異丁醇、異丁酸等考察外源性前體物對巴弗洛霉素生物合成的影響，以期通過前體物質(zhì)的添加提高巴弗洛霉素A1的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 菌種鏈霉菌FIM-B0711由本研究室篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：ISP2。分離平板培養(yǎng)基：ISP2。種子培養(yǎng)基：麥芽浸粉 2.0%；蛋白胨 2.0%；CaCO31.0%。（pH為7.2）。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉4.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉2.0%、玉米漿1.5%、碳酸鈣0.2%（pH為7.0）

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 斜面28℃培養(yǎng)10-12 d待孢子生長成熟以后，刮取新鮮孢子接于種子培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)、搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，培養(yǎng)48 h左右；按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，后置于28℃、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，振蕩培養(yǎng)120 h。

1.2.2 巴弗洛霉素A1的高效液相色譜（HPLC）檢測法 樣品處理：發(fā)酵液加入2倍體積乙醇，混勻、超聲20 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液即為待測液。

HPLC分析方法：Agilent 1200 series高效液相色譜儀，Syncronis C18 分析柱（4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm），流動相為甲醇：水=85∶15，進(jìn)樣量為10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長248 nm，柱溫：40℃。根據(jù)樣品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)液峰面積×標(biāo)準(zhǔn)液濃度計算產(chǎn)量。

1.2.3 菌絲濃度測定 采用PMV（Packed Mass Volume）法，取發(fā)酵液10 mL于10 mL刻度試管中，于5 000 r/min離心 15 min，記錄沉淀物毫升數(shù)。依下列計算菌絲濃度：菌絲濃度=（沉淀物毫升數(shù)/10）×100%。

1.2.4 總糖的測定 斐林試劑測定法［20]

1.2.5 氨基氮的測定 甲醛法［21]

1.2.6 不同前體對巴弗洛霉素A1生物合成的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)24 h后分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.1%的醋酸鈉、丙酸鈉、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異丁醇、異丁酸，繼續(xù)培養(yǎng)，在發(fā)酵120 h時測定發(fā)酵液中巴弗洛霉素A1產(chǎn)量及菌絲濃度，確定最佳前體物質(zhì)。以無添加前體物的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。

1.2.7 前體添加濃度對巴弗洛霉素A1生物合成的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)24 h后分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的最佳前體物，發(fā)酵結(jié)束后測定巴弗洛霉素A1產(chǎn)量、菌絲濃度及pH值，確定最佳添加濃度。以無添加前體物的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。

1.2.8 前體加入時間的考察 分別在發(fā)酵培養(yǎng)的第0、12、24、36、48、60、72 h時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入最佳前體，發(fā)酵結(jié)束后測定巴弗洛霉素A1產(chǎn)量、菌絲濃度及pH值，確定最佳加入時間，以無添加前體物的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。

1.2.9 發(fā)酵罐上補料實驗 新鮮斜面接入裝量為80 mL/500 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后合并種子液，按5.0%左右的接種量移種到20 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過攪拌及通氣量控制發(fā)酵液DO值在30%-60%之間，一般通氣為1∶0.8-1.5 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速在200-500 r/min之間。在發(fā)酵進(jìn)行到36 h時一次性加入發(fā)酵液體積0.2%的纈氨酸溶液。

2 結(jié)果

2.1 不同前體對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

圖1顯示，添加0.1%纈氨酸可促進(jìn)菌體生長及有效提高巴弗洛霉素A1發(fā)酵產(chǎn)量，達(dá)217.6 mg/mL，比對照組提高約36.0%；添加0.1%甲硫氨酸對菌體生長影響不大，但可提高巴弗洛霉素A1發(fā)酵產(chǎn)量，達(dá)到184.2 mg/mL，比對照組提高了約15.0%；添加0.1%的乙酸鈉和丙酸鈉對巴弗洛霉素A1產(chǎn)量和生物量沒有明顯影響；而添加0.1%的異丁醇和異丁酸可以提高巴弗洛霉素效價，但效果不明顯且會抑制菌體生長；而亮氨酸、異亮氨酸可以促進(jìn)菌體生長，但會降低巴弗洛霉素A1的產(chǎn)量；由此可見纈氨酸為最佳的外源前體物，后續(xù)實驗選擇纈氨酸進(jìn)行最適添加量及添加時間的研究。

圖1 不同前體物對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

2.2 纈氨酸添加濃度對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

圖2顯示，在發(fā)酵24 h左右往培養(yǎng)基中添加纈氨酸濃度為0-0.1%時，菌體濃度持續(xù)增加，巴弗洛霉素效價也增加；當(dāng)纈氨酸濃度達(dá)到0.2%時，菌體濃度開始下降，但此時巴弗洛霉素A1效價達(dá)到最高；繼續(xù)加大氨基酸添加量后菌體濃度持續(xù)下降，巴弗洛霉素A1效價也跟著下降。有可能是因為高濃度纈氨酸對菌體產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致生物量的減少進(jìn)而降低發(fā)酵效價。因此，確定前體纈氨酸的最佳添加量為0.2%，此條件下巴弗洛霉素A1產(chǎn)量為264.5 mg/mL，比對照提高了65.3%。

2.3 纈氨酸添加時間的選擇

圖3顯示，在第36 h添加纈氨酸時，巴弗洛霉素A1產(chǎn)量及菌絲濃度均比對照組有所提高，此時添加纈氨酸效果最好，巴弗洛霉素A1產(chǎn)量高達(dá)285.5 mg/mL，比對照組提高了78.4%。

圖2 纈氨酸添加量對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

從圖3上生物量的變化可以看出，在培養(yǎng)0-24 h時加入纈氨酸，菌絲濃度逐漸增加，發(fā)酵效價也升高，可能是由于部分纈氨酸作為細(xì)胞生長的碳源而促進(jìn)生長，另外纈氨酸也會誘導(dǎo)次級代謝的酶活從而提高效價；而第36 h是處在鏈霉菌FIM-B0711開始進(jìn)入次級代謝產(chǎn)物巴弗洛霉素合成的階段，此時加入纈氨酸，大部分能作為次級代謝前體物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為丙酰CoA合成巴弗洛霉素A1，因此發(fā)酵效價最高。

在培養(yǎng)48 h之后加入纈氨酸，巴弗洛霉素A1產(chǎn)量下降，而生物量反而有所上升，這可能是由于纈氨酸是初級代謝產(chǎn)物有可能引起菌體二次生長而改變生物合成進(jìn)程從而降低發(fā)酵效價。所以最佳的前體物補料時機(jī)為在發(fā)酵培養(yǎng)36 h時加入0.2%的纈氨酸。

圖 3 纈氨酸添加時間對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

2.4 發(fā)酵過程考察

在20 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵試驗，在培養(yǎng)36 h左右，往發(fā)酵罐加入總量0.2%的纈氨酸溶液，對照組為不添加纈氨酸發(fā)酵罐。

由圖4可以看出，添加纈氨酸發(fā)酵時總糖消耗速率較快，說明纈氨酸可以提高菌體的代謝合成。氨基氮曲線的變化可以看到，沒有添加前體物的發(fā)酵過程，前36 h由于菌體細(xì)胞的生長和繁殖消耗了大量的氨基氮，導(dǎo)致氨基氮含量下降較快，同時伴隨著pH值的下降；之后氨基氮消耗緩慢，此時pH值有所回升；在發(fā)酵后期（發(fā)酵72 h后），氨基氮緩慢回升，而pH值也在升高，可能是由于發(fā)酵后期菌體開始衰老、自溶，釋放部分氨基氮。而在36 h時添加纈氨酸可以看到氨基氮在36-48 h恢復(fù)到較高水平，然后再下降，在60 h后又開始緩慢上升；這可能是由于添加氨基酸后促進(jìn)菌體生長和代謝合成，隨著發(fā)酵的進(jìn)行氨基酸被大量消耗而導(dǎo)致氨基氮減少，發(fā)酵后期產(chǎn)物大量合成，菌體開始自溶，氨基氮又緩慢回升。

圖4 發(fā)酵曲線對比

由于發(fā)酵過程控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速以盡量保證菌體對氧的需求，所以兩種發(fā)酵方式的溶氧曲線變化基本一致。在發(fā)酵0-36 h隨著菌體的快速生長，DO值迅速下降到30%左右，此時提高轉(zhuǎn)速增加發(fā)酵液中氧氣含量，在發(fā)酵中后期菌體進(jìn)入次級代謝合成期對氧的需求開始下降，此時可以適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速，以減少攪拌剪切力對菌絲體的損傷。

從菌絲濃度變化的曲線可以看出，巴弗洛霉素A1發(fā)酵過程中存在兩個階段（菌體生長期和產(chǎn)物合成期），發(fā)酵前期（0-36 h）菌體生長、繁殖較快，為菌體生長期，36-96 h菌絲濃度增長緩慢，此時開始大量合成次級代謝產(chǎn)物巴弗洛霉素A1；在發(fā)酵后期，96-120 h菌體細(xì)胞開始衰亡自溶，巴弗洛霉素A1累積速度變慢，發(fā)酵120 h時巴弗洛霉素A1產(chǎn)量達(dá)到峰值。在發(fā)酵36 h時添加纈氨酸可以明顯促進(jìn)菌絲體生長和大大提高巴弗洛霉素A1的生物合成速率和產(chǎn)量，120 h是巴弗洛霉素A1產(chǎn)量達(dá)到282.5 mg/L。

3 討論

目前已有公開報道的巴弗洛霉素發(fā)酵產(chǎn)量都不高。魏剛等［11]報道從海洋放線菌Y12-26發(fā)酵獲得bafilomycin A1，效價極低。潘華奇等［22]報道卡伍爾鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的bafilomycin B1和bafilomycin C1含量分別達(dá)23.45 mg/L 和6.603 mg/L。楊巍民等［23]報道在40 L海洋放線菌Y-0117發(fā)酵液中獲得 bafilomycin D 純 品 約 0117A（14.7 mg）。Werner等［6]報道從100 L灰色鏈霉菌的發(fā)酵液中分離獲得 bafliomycins A1 45 mg、A2 36 mg、C1 120 mg，Yu等［24]從鏈霉菌YIM56209的9.6 L發(fā)酵液中獲得bafliomycins C1 1.8mg。Carr等［25]從海洋放線菌發(fā)酵液中分離到bafilomycin F。Lee等［26]報道在發(fā)酵過程添加80 mmol/L 纈氨酸添加可以使 bafilomycin產(chǎn)量達(dá)到35 mg/L。由此可見已有報道巴弗洛霉素發(fā)酵產(chǎn)量均太低，生產(chǎn)成本高，不足以實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

巴弗洛霉素A1大環(huán)內(nèi)酯核心由I型PKS系統(tǒng)組裝，其聚酮延伸前體物為甲基丙二酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲氧基丙二酰輔酶A等［27-28]。這些短鏈脂肪酸?；鵆oA可以通過脂肪酸或支鏈氨基酸等物質(zhì)代謝獲得［29]。因此在發(fā)酵培養(yǎng)過程中加入適量前體物質(zhì)，通過代謝調(diào)控，可能縮短其生物合成周期，提高巴弗洛霉素的產(chǎn)量。但如果外源前體在發(fā)酵液中的殘留濃度過高，又會使生產(chǎn)菌中毒，而不利于產(chǎn)物的生物合成。因此，研究適當(dāng)?shù)那绑w添加策略對有些次級代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)有重要意義。

添加纈氨酸可以提高巴弗洛霉素產(chǎn)量的原因可能是纈氨酸在菌體內(nèi)代謝可得異丁酸，其是巴弗洛霉素生物合成的起始單元［26]，外源性地增加巴弗洛霉素生物合成起始單元可以大大地促進(jìn)其生物合成。而添加亮氨酸或異亮氨酸抑制會乙酰羧酸合成酶（受單個末端產(chǎn)物抑制），使得胞內(nèi)合成的纈氨酸減少［30]，從而降低產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本文研究表明，纈氨酸作為前體物對巴弗洛霉素A1生物合成的促進(jìn)作用優(yōu)于甲硫氨酸、異丁醇及異丁酸，是較適宜的前體。在發(fā)酵培養(yǎng)36 h時添加0.2%纈氨酸，巴弗洛霉素A1產(chǎn)量高達(dá)285.5 mg/L，比對照組提高了78.4%。且這一實驗在20 L發(fā)酵罐上得以實現(xiàn)，為下一步菌株選育及發(fā)酵放大實驗提高基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。