黨參多糖對Ana-1巨噬細(xì)胞和小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

史寶忠 胡建燃 李平 徐凱

（長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，長治 046011）

黨參是我國傳統(tǒng)的大宗中藥，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺等功效。在2015版《中華人民共和國藥典》中記載：黨參為桔?？浦参稂h參［Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]、 川 黨 參（Codonopsis tangshenOliv.）、 素 花 黨 參［Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen]等多種同屬植物的干燥根［1]。主要有效成分有多糖類、生物堿、皂苷等。其中，黨參多糖主要由戊糖、己糖及其衍生物糖醇、糖酸組成，具有抗氧化和抗衰老［2]、調(diào)節(jié)免疫［3]、促進(jìn)機(jī)體造血［4]的功能，臨床可用于降糖降脂等。

目前，針對黨參多糖的研究主要集中于提取工藝、含量測定、多糖結(jié)構(gòu)解析以及藥理作用方面。在免疫調(diào)節(jié)方面，已有文獻(xiàn)報道了輪葉黨參［5]、素花黨參［6]、道真洛龍黨參［7]等不同品種的黨參多糖成分或其制劑對巨噬細(xì)胞株釋放炎癥性因子，以及小鼠［8]、大鼠［9]、肉仔雞［10]、仔豬［11]等動物的免疫功能的調(diào)節(jié)活性。本研究以山西省南部道地藥材潞黨參的多糖為研究對象，分析其對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1產(chǎn)生TNF-α和IL-1β的影響，進(jìn)而通過體內(nèi)實驗，探討了黨參多糖對小鼠免疫器官、血清中炎癥性因子等的影響，分析其對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京索來寶生物科技有限公司；胎牛血清購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；胰蛋白酶、四氮甲基唑藍(lán)（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、青鏈霉素、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）等購自北京依托華茂生物科技有限公司；小鼠 IL-1β ELISA 試劑盒和小鼠TNF-α ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 材料 黨參購自山西省長治市昂生大藥房；小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1購自武漢博士德生物工程有限公司；昆明種小鼠共30只，雌性，每只（20 ± 2）g，由山西康寶生物制品股份有限公司提供。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國熱電公司）；細(xì)胞計數(shù)儀Cellometer Auto1000（美國Nexcelom公司）；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M2（美谷分子儀器（上海）有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（HITACHI）。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗 本研究以山西省長治市所產(chǎn)的道地藥材潞黨參為材料，通過傳統(tǒng)的水提醇沉法獲得粗多糖，然后通過Sevag 法脫蛋白和透析法除去小分子進(jìn)行精制，即得黨參多糖樣品。具體方法參照文獻(xiàn)［12]。前期研究顯示高于0.25 mg/mL的黨參多糖會抑制人宮頸癌細(xì)胞SiHa細(xì)胞生長［13]，因此本研究以終濃度為0.01、0.03、0.06、0.12和0.25 mg/mL的黨參多糖處理小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1，并參照該文獻(xiàn)中的方法，按照1×104個/孔的濃度，將Ana-1細(xì)胞接種到96孔板中，用不同濃度的黨參多糖處理，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液，測定OD570值，然后計算細(xì)胞存活率。

1.2.2 Ana-1細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β含量的測定 用不同濃度的黨參多糖處理Ana-1細(xì)胞48 h后，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.3 動物分組及處理 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為陰性對照組、陽性對照組及黨參多糖高、中、低劑量組。參照文獻(xiàn)［7，14-15]，設(shè)置陽性對照組灌胃鹽酸左旋咪唑（40 mg/kg），高、中、低劑量組分別灌胃0.62、0.31和0.16 mg/g體重的黨參多糖，連續(xù)灌胃10 d，陰性對照組給予等體積的生理鹽水。實驗期間各組小鼠自由采食、飲水。

1.2.4 小鼠胸腺指數(shù)的測定 將小鼠處死后，取出胸腺，用濾紙吸干后，準(zhǔn)確稱重，然后按公式：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）計算各組小鼠的胸腺指數(shù)。

1.2.5 小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的測定 在無菌條件下，將小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106個/mL，按照每孔 200 μL加入到96孔培養(yǎng)板中。再加入終濃度為2 μg/mL的ConA，同時設(shè)空白對照（只加細(xì)胞懸液），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h。取出培養(yǎng)板，每孔中加入 10%的MTT 溶液（儲液濃度5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后，每孔中加入 100 μL DMSO，振搖 10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀讀取 570 nm 波長處 OD值。按照公式“淋巴細(xì)胞增殖指數(shù) =實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值”計算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.2.6 小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的測定 將取得的小鼠血液在室溫下自然凝固 15 min，3 000 r/m離心10 min。小心收集上清液，待用。采用 ELLSA法測定小鼠血清中TNF-α和 IL-1β含量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s表示。利用SPSS 10.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 黨參多糖對Ana-1細(xì)胞存活的影響

分別用終濃度為0.01、0.03、0.06、0.12和0.25 mg/mL的黨參多糖處理小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1 48 h后，利用MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖1所示，上述濃度的黨參多糖都不影響Ana-1細(xì)胞的生長，存活率均接近100%。

圖1 黨參多糖對Ana-1細(xì)胞存活的影響

2.2 黨參多糖對Ana-1細(xì)胞TNF-α和IL-1β釋放的影響

不同濃度的黨參多糖處理Ana-1細(xì)胞48 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書，分別檢測培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1β的含量。結(jié)果如圖2所示，與未加多糖的空白對照組細(xì)胞相比較，黨參多糖濃度越高，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量越高，當(dāng)多糖終濃度達(dá)到3.13 mg/mL時，TNF-α的釋放量顯著增多（P＜0.05），當(dāng)黨參多糖濃度高于6.25 mg/mL后，TNF-α釋放量增加極顯著（P＜0.01）。黨參多糖對Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響結(jié)果如圖3所示，當(dāng)其終濃度高于6.25 mg/mL時，Ana-1細(xì)胞IL-1β產(chǎn)生增加極顯著（P＜0.01）。因此，黨參多糖能夠在體外明顯增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的釋放量。

圖2 黨參多糖對Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響

圖3 黨參多糖對Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響

2.3 黨參多糖對小鼠胸腺指數(shù)的影響

由表1可知，鹽酸左旋咪唑?qū)嶒灲M（陽性對照）與生理鹽水實驗組（陰性對照）相比，胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05），表明鹽酸左旋咪唑能使小鼠免疫功能增強(qiáng)。與陰性對照組相比，黨參多糖中、高劑量組能顯著提高小鼠胸腺指數(shù)（P＜0.05）。

表1 小鼠胸腺指數(shù)測定結(jié)果（±s，n=5）

表1 小鼠胸腺指數(shù)測定結(jié)果（±s，n=5）

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.05

實驗組 胸腺指數(shù)（mg/g）生理鹽水 4.34±0.45鹽酸左旋咪唑（mg/g） 0.04 4.99±0.92*黨參多糖（mg/g） 0.16 3.25±0.74*0.31 5.26±0.18*0.62 4.74±0.32*

2.4 黨參多糖對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，Con A誘導(dǎo)下，與陰性對照生理鹽水組相比，陽性對照鹽酸左旋咪唑極顯著地增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（P＜0.01）。與陰性對照組相比，中劑量的黨參多糖能顯著地（P＜0.05）提高淋巴細(xì)胞的增殖；高劑量的黨參多糖則極顯著地增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞的增殖能力（P＜0.01）。

2.5 黨參多糖對小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平的影響

由圖4所示，與陰性對照生理鹽水組（164.54±26.26 pg/mL）相比，陽性對照鹽酸左旋咪唑極顯著地提高了小鼠血清紅TNF-α的水平（452.25±28.97 pg/mL，P＜0.01）。中劑量和高劑量黨參多糖也能極顯著提高小鼠血清中TNF-α水平（P＜0.01），分別為264.13±33.56 pg/mL和 377.13±31.85 pg/mL。由圖5所示，與生理鹽水組（106.60±2.51 pg/mL）相比，中濃度和高濃度的黨參多糖極顯著增高了小鼠血清中IL-1β的含量（P＜0.01），分別為 132.96±7.10 pg/mL和162.36±9.97 pg/mL。但是，低劑量的黨參多糖對小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平的影響，沒有顯著性差異。

表2 黨參多糖對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n=5）

表2 黨參多糖對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n=5）

注：與生理鹽水組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01

實驗組 淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)生理鹽水 2.61±0.17鹽酸左旋咪唑（mg/g） 0.04 3.61±0.34**黨參多糖（mg/g） 0.16 2.55±0.11 0.31 3.32±0.36*0.62 3.93±0.32**

圖4 黨參多糖對小鼠血清中TNF-α水平的影響

3 討論

在免疫應(yīng)答過程中，巨噬細(xì)胞通過吞噬作用清除侵入機(jī)體的病原微生物，然后通過抗原加工和提呈，從而發(fā)揮抗體依賴的免疫作用［16-17]。此外，當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，還會產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。如NO、TNF-α、多種白細(xì)胞介素等，參與機(jī)體多種生理過程。TNF-α是一種參與天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子，能激活其他免疫細(xì)胞，同時能誘導(dǎo)白細(xì)胞趨化運動及其表明黏附分子的表達(dá)，從而選擇性抑制某些腫瘤細(xì)胞。Qin等［18]發(fā)現(xiàn)硒化黨參多糖能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬功能，以及NO、TNF-α和IL-6 的釋放，而且可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，并誘導(dǎo) TNF-α和 IL-6 的分泌。石軼男等［19]發(fā)現(xiàn)黨參多糖可能通過NF-κB信號通路增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的TNF-α和IL-6產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖能有效增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的TNF-α分泌量，并且前期研究顯示當(dāng)黨參多糖濃度高于12.5 mg/mL后，TNF-α分泌量無顯著改變。進(jìn)一步的體內(nèi)實驗也表明，黨參多糖顯著提高了小鼠血清中TNF-α的含量，接近陽性對照鹽酸左旋咪唑的效果，與上述結(jié)果一致。

圖5 黨參多糖對小鼠血清中IL-1β水平的影響

IL-1β是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一種主要促炎因子，有活化的巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，且體外實驗研究顯示，IL-1β可直接殺傷多種腫瘤細(xì)胞［20-21]。閻海青等［22]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓多酚能抑制RAW264.7細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)；張東芳等［23]的研究顯示表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α和Il-1β的表達(dá)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)；康峰［24]的研究則顯示靈芝多糖能有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性。本實驗發(fā)現(xiàn)黨參多糖能顯著提高巨噬細(xì)胞Ana-1的IL-1β分泌量和小鼠血清中IL-1β水平，因此黨參多糖可能發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

胸腺和脾臟是人類和動物體內(nèi)主要的免疫器官，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)主要反映了機(jī)體非特異免疫能力的強(qiáng)弱。脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的淋巴器官和血流通路中的過濾器官，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心［25]。賈林等［26]研究表明，桔梗多糖能明顯增加免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，顯著提高血清中IL-2和TNF-α的含量并呈劑量依賴性。林丹丹等［14]發(fā)現(xiàn)黨參多糖在硒化后，更能夠提高免疫器官指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖能力和血清免疫球蛋白分泌等作用。本研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖能夠顯著增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖，提高實驗小鼠的胸腺指數(shù)，并呈劑量依賴關(guān)系，高劑量（0.62 mg/g）的黨參多糖與陽性對照鹽酸左旋咪唑（0.04 mg/g）的效果相當(dāng)。

4 結(jié)論

黨參多糖在體外不影響小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的增殖，卻顯著增強(qiáng)其TNF-α和IL-1β的分泌；進(jìn)一步的體內(nèi)實驗表明，在ConA刺激下，黨參多糖能明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，提高小鼠的胸腺指數(shù)及其血清中TNF-α和IL-1β的含量，均呈劑量依賴關(guān)系。