銻脅迫對(duì)斑馬魚(yú)酶活性的影響研究

岳鑫 楊愛(ài)江，2，3 徐鵬 胡霞，2，3 朱桓毅 包欣

（1. 貴州大學(xué)，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)環(huán)境工程規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，貴陽(yáng) 550025；3. 貴州大學(xué)科技園發(fā)展有限公司，貴陽(yáng) 550025）

由于工業(yè)迅速發(fā)展，銻（Antimony，Sb）及其化合物受到越來(lái)越多的關(guān)注，并在環(huán)境中呈現(xiàn)高濃度水平［1-2]，尤其富礦區(qū)域分布集中且濃度較高［3]。銻作為一種新興的全球性環(huán)境污染物，對(duì)生物體存在慢性毒性和潛在致癌性的危險(xiǎn)物質(zhì)，被美國(guó)環(huán)保署和歐洲多國(guó)列為優(yōu)先防治污染物，在巴塞爾公約中，銻被列為可越境遷移的環(huán)境染物之一［4]。中國(guó)是產(chǎn)銻大國(guó)，全球超過(guò)90%的銻來(lái)自中國(guó)［5]。礦井廢水及殘留物是銻最大的來(lái)源和濃度高的區(qū)域［6-7]。因此，伴隨著銻礦的開(kāi)采、冶煉，大量的銻流入到空氣、水體及土壤中，通過(guò)呼吸，皮膚吸收及食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體的心臟、皮膚等器官造成傷害［8-9]。盧莎莎等［10]測(cè)定了都柳江干流和支流水體中的銻含量發(fā)現(xiàn)，都柳江部分水體中含銻量高達(dá)2 223 μg/L，反映出我國(guó)面臨嚴(yán)峻的銻污染狀況。

近年來(lái)，研究學(xué)者對(duì)銻的毒性試驗(yàn)研究進(jìn)行了報(bào)道。王安等［11]以小鼠為受體，發(fā)現(xiàn)銻引起小鼠肝損害的機(jī)理與其損傷肝線粒體的抗氧化能力，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)。王凱［12]研究發(fā)現(xiàn)銻能夠?qū)︱球窘饘倭虻鞍桩a(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，且蚯蚓金屬硫蛋白含量與銻暴露濃度呈顯著正相關(guān)。Yang［13]研究表明三價(jià)銻對(duì)青蝦的半數(shù)致死濃度是1.962 6 mg/L。綜上研究表明銻對(duì)生物體都具有明顯的毒性效應(yīng)。

為了研究銻脅迫下，生物體內(nèi)各類酶活性的變化，本研究選取斑馬魚(yú)為受體進(jìn)行試驗(yàn)，了解生物對(duì)銻脅迫的響應(yīng)機(jī)制。斑馬魚(yú)與人的基因相似度高達(dá)87%［14]，是一種模式生物，其生長(zhǎng)周期短、魚(yú)卵體外受精易收集、魚(yú)身通體透明［15]，被廣泛用于生態(tài)毒理學(xué)研究。近年來(lái)，銻對(duì)斑馬魚(yú)毒性的研究基本僅限于半數(shù)致死濃度及富集系數(shù)，而銻脅迫對(duì)斑馬魚(yú)的酶活性效應(yīng)研究鮮有報(bào)道。過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（Peroxisome，POD）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）隸屬于生物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以消除多余自由基，維持體內(nèi)自由基在一個(gè)正常的水平內(nèi)，保護(hù)細(xì)胞［16-17]。Na+K+-ATPase酶既是酶又是載體，可以催化ATP水解，同時(shí)也是組成Na+-K+泵活性的主要成分［18]。神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞要靠乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）來(lái)維持［19]。乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）是在細(xì)胞內(nèi)催化乳酸氧化成丙酮酸的重要酶［20]。磷酸酶參與一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、運(yùn)輸，還是生物體內(nèi)重要的解毒體系，在蛋白質(zhì)去磷酸化過(guò)程中也起著十分重要的作用［21]。根據(jù)其反應(yīng)的pH環(huán)境分為酸性磷酸酶（Lactate dehydrogenase，ACP）和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）。因此，本研究以斑馬魚(yú)為受體做毒性試驗(yàn)，研究不同影響因素下斑馬魚(yú)體內(nèi)CAT、POD、SOD、AchE、LDH、Na+K+-ATPase酶、ACP和AKP活性的變化，從而探討銻脅迫下斑馬魚(yú)體內(nèi)酶系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)及斑馬魚(yú)應(yīng)對(duì)銻脅迫的響應(yīng)機(jī)制。以期類比人體受銻脅迫時(shí)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)及體內(nèi)酶系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制，了解銻對(duì)人體的毒害作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú) 市售斑馬魚(yú)，體長(zhǎng)3-4 cm，在實(shí)驗(yàn)室條件（24 h曝氣，26℃，光暗周期為t（光）∶t（暗）=12 h∶12 h），用曝氣3 d的自來(lái)水馴養(yǎng)1個(gè)月。每日吸取糞便及殘余餌料，并置換1/2的水（曝氣3 d），每日喂食（水騷干）兩次，直至死亡率小于1%方可用于毒理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前24 h停止喂食。

1.1.2 器材 紫外分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、冷凍勻漿機(jī)、水浴鍋、分析天平、容量瓶等。

1.1.3 試劑 過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒（可見(jiàn)光法）、總超氧化物歧化酶測(cè)試盒（羥胺法）、過(guò)氧化物酶測(cè)定試劑盒（比色法）、超微量Na+K+-ATP酶測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿酯酶測(cè)試盒、乳酸脫氫酶試劑盒（比色法）、酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒（分光光度法）、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒（可見(jiàn)光比色法）、總蛋白測(cè)定試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法）（所有試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所），酒石酸銻鉀、NaCl等。

1.2 方法

1.2.1 銻脅迫下斑馬魚(yú)酶活性的變化 用曝氣3 d的自來(lái)水和酒石酸銻鉀配制銻溶液（0、10、20、30和40，0 mg/L為對(duì)照組），準(zhǔn)備5個(gè)10 L魚(yú)缸，分別加入不同濃度的銻溶液和20尾體長(zhǎng)3-4 cm、禁食24 h的成年斑馬魚(yú)。定期（24、48、96和144 h）取出斑馬魚(yú)，用生理鹽水洗凈后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將斑馬魚(yú)樣品制備成組織勻漿，通過(guò)酶活試劑盒對(duì)斑馬魚(yú)勻漿液進(jìn)行處理，再用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，CAT、POD、SOD、AchE、LDH、ATP、ACP和AKP活性的變化情況。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均測(cè)了3組平行，全部取平均值，用Origin9.1進(jìn)行圖片繪制，用SPSS 20進(jìn)行顯著性分析等。

2 結(jié)果

2.1 Sb對(duì)斑馬魚(yú)抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響

2.1.1 Sb對(duì)CAT活性的影響 圖1展示了銻對(duì)斑馬魚(yú)CAT活性的影響，培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，與對(duì)照組

圖1 銻對(duì)斑馬魚(yú)CAT活力的影響

2.1.2 Sb對(duì)SOD活性的影響 圖2展示了銻對(duì)斑馬魚(yú)SOD活性的影響，從圖中看出，隨著銻脅迫時(shí)間增加，銻含量為20、30和40 mg/L時(shí)SOD活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)；在24、48和144 h時(shí)，各濃度組SOD活性基本都小于對(duì)照組，在96 h時(shí)，各濃度組酶活性都大于對(duì)照組。

圖2 銻對(duì)斑馬魚(yú)SOD活力的影響

2.1.3 Sb對(duì)POD活性的影響 銻對(duì)斑馬魚(yú)POD活性的影響由圖3可見(jiàn)，在24和144 h時(shí)，各濃度組POD活性均低于對(duì)照組，在48 h時(shí)，除40 mg/L時(shí)POD活性低于對(duì)照組，其余濃度組POD活性均高于對(duì)照組；在96 h時(shí)，10和40 mg/L濃度組POD活性濃度相比，不同銻濃度都對(duì)CAT活性有顯著的抑制作用，銻濃度為10 mg/L時(shí)，在48、96和144 h時(shí)CAT活性均大于對(duì)照組，銻濃度為20 mg/L時(shí)，CAT活性隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)。低于對(duì)照組，20和30 mg/L濃度組POD活性高于對(duì)照組。

圖3 銻對(duì)斑馬魚(yú)POD活力的影響

2.2 Sb對(duì)斑馬魚(yú)Na+K+-ATPase酶活性的影響

銻對(duì)斑馬魚(yú)Na+K+-ATPase酶活性的影響見(jiàn)圖4，由圖可知，在24 h時(shí)，不同濃度Sb脅迫下斑馬魚(yú)Na+K+-ATPase酶活性均低于對(duì)照組，隨時(shí)間增加，10和20 mg/L濃度組酶活性也顯著增加；30和40 mg/L濃度組在48和96 h酶活性都呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而后隨時(shí)間增加到144 h，酶活性升高。

圖4 銻對(duì)斑馬魚(yú)Na+K+-ATPase活力的影響

2.3 Sb對(duì)斑馬魚(yú)乙酰膽堿酶活性的影響

銻對(duì)斑馬魚(yú)AchE活性的影響見(jiàn)圖5，由圖可知，在24 h時(shí)，各個(gè)濃度組銻脅迫下的AchE活性均低于對(duì)照組，隨著時(shí)間增加，低濃度組（10 mg/L）對(duì)AchE活性呈誘導(dǎo)效應(yīng)，高濃度組（30和40 mg/L）對(duì)酶活仍呈抑制作用。

圖5 銻對(duì)斑馬魚(yú)AchE活力的影響

2.4 Sb對(duì)斑馬魚(yú)乳酸脫氫酶活性的影響

銻對(duì)斑馬魚(yú)LDH活性的影響見(jiàn)圖6，由圖可知，在24 h時(shí)，各濃度組酶活性均低于對(duì)照組，在48和96 h時(shí)，低濃度組（10和20 mg/L）酶活性高于對(duì)照組，高濃度組（30和40 mg/L）酶活性低于對(duì)照組，LDH酶活性隨銻脅迫濃度增加整體呈現(xiàn)“鋸齒形”變化趨勢(shì)。

圖6 銻對(duì)斑馬魚(yú)LDH活力的影響

2.5 Sb對(duì)斑馬魚(yú)磷酸酶活性的影響

2.5.1 Sb對(duì)ACP活性的影響 Sb對(duì)斑馬魚(yú)ACP活性的影響見(jiàn)圖7，從圖中可知，隨著時(shí)間增加，其ACP活性呈“鋸齒形”變化趨勢(shì)，在24 h時(shí)，各濃度組ACP活性均低于對(duì)照組，低濃度時(shí)（10 mg/L），在48和96 h時(shí)的 ACP活性均高于對(duì)照組，而144 h時(shí)ACP活性則低于對(duì)照組。

圖7 銻對(duì)斑馬魚(yú)ACP活力的影響

2.5.2 Sb對(duì)AKP活性的影響 Sb對(duì)斑馬魚(yú)AKP活性的影響見(jiàn)圖8，從圖中可見(jiàn)，在24 h時(shí)，低濃度組（10和20 mg/L）酶活性低于對(duì)照組，高濃度組（30和40 mg/L）酶活性則高于對(duì)照組。在48 h時(shí)，各濃度組AKP酶活性均高于對(duì)照組，在96 h時(shí)，10、20和30 mg/L酶活性高于對(duì)照組，而40 mg/L酶活性則低于對(duì)照組。

圖8 銻對(duì)斑馬魚(yú)AKP活力的影響

3 討論

3.1 顯著性分析

利用Univariat模型，分別對(duì)8種酶活性隨時(shí)間增加和Sb濃度增加的變化情況進(jìn)行顯著性分析。

結(jié)果由表1可知，除AKP活性隨時(shí)間增長(zhǎng)一般顯著外，其他酶活性隨時(shí)間和Sb濃度變化均呈極顯著，表明酶活性對(duì)時(shí)間和Sb濃度變化敏感度較強(qiáng)，數(shù)據(jù)有一定的統(tǒng)計(jì)意義。

表1 銻濃度及時(shí)間對(duì)酶活性變化的顯著性分析

3.2 Sb對(duì)斑馬魚(yú)抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響

生物體內(nèi)的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）是代謝過(guò)程中必不可少的產(chǎn)物，通常情況ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而當(dāng)生物處于重金屬脅迫、有機(jī)物污染等逆境中時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生大量ROS，主要包括超氧陰離子過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH），少量的ROS能作為細(xì)胞信號(hào)因子［22]，參與激活機(jī)體的抗氧化信號(hào)通路［23]，但大量ROS堆積就會(huì)損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等大分子，損傷若不能及時(shí)修復(fù)就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化損傷［24]，也就是氧化應(yīng)激反應(yīng)。CAT、SOD和POD廣泛存在于真核生物的各類細(xì)胞中，是抗氧化酶系統(tǒng)中比較重要的3種酶［25]。

3.2.1 Sb對(duì)CAT活性的影響 CAT可以將H2O2還原成H2O，阻止其與O2反應(yīng)生成·OH［25]。低濃度（10 mg/L）的銻對(duì)CAT活性有一定的促進(jìn)作用，可能是因?yàn)榘唏R魚(yú)在銻脅迫下產(chǎn)生大量ROS，迫使機(jī)體產(chǎn)生大量CAT來(lái)調(diào)節(jié)ROS正常濃度范圍，是斑馬魚(yú)對(duì)銻適應(yīng)的一種表現(xiàn)，這與陳立偉［26]探究鎘對(duì)黃顙魚(yú)CAT的影響一致。隨著銻的濃度逐漸升高、脅迫時(shí)間逐漸增加，斑馬魚(yú)機(jī)體內(nèi)的平衡可能被打破，大量的ROS堆積導(dǎo)致CAT活性降低，這表明斑馬魚(yú)可能由適應(yīng)銻變成了銻中毒，過(guò)量ROS可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)、DNA等大分子，造成機(jī)體損傷。

3.3 Sb對(duì)斑馬魚(yú)Na+K+-ATPase酶活性的影響

Na+K+-ATPase酶與膜上磷脂的結(jié)合狀態(tài)能影響膜的功能，還參與物質(zhì)運(yùn)輸、氧化磷酸化以及能量代謝等生理生化過(guò)程，對(duì)維持離子梯度具有重要的意義［31]。從本次研究結(jié)果來(lái)看，在短時(shí)間內(nèi)各濃度組Na+K+-ATPase酶活性均低于對(duì)照組，表明銻可以在短時(shí)間內(nèi)影響斑馬魚(yú)的Na+K+-ATPase酶活性，Na+K+-ATPase酶活性降低可能是因?yàn)殇R離子進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)與其膜上的ATP酶結(jié)合，從而改變ATP酶的空間結(jié)構(gòu)，阻止其與底物的結(jié)合，最終抑制了酶活性［32]。進(jìn)而影響斑馬魚(yú)物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝等生理生化過(guò)程，隨時(shí)間增加出現(xiàn)的Na+K+-ATPase酶活性增高的情況，可能是因?yàn)榘唏R魚(yú)自身的調(diào)節(jié)功能，對(duì)銻脅迫產(chǎn)生了一定的適應(yīng)。

3.4 Sb對(duì)斑馬魚(yú)乙酰膽堿酶活性的影響

AchE廣泛存在于各種動(dòng)物組織中，在神經(jīng)突觸間隙中，通過(guò)催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿來(lái)終止其對(duì)膽堿受體的興奮作用，維持神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞［19]，其活性升高則會(huì)抑制興奮地傳遞，活性降低則表現(xiàn)為過(guò)度興奮，無(wú)論其活性升高或者降低都會(huì)影響斑馬魚(yú)正常的生理生化功能［33]。由圖5可知，短時(shí)間（24 h）內(nèi)各濃度組的AchE活性均低于對(duì)照組，表現(xiàn)出短時(shí)間內(nèi)的毒物興奮作用［33]，隨脅迫時(shí)間的增加，低濃度組AchE活性有些許增加，銻對(duì)AchE活性的抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)作用，抑制了其興奮的傳導(dǎo)，但高濃度組的AchE活性隨時(shí)間增加一直保持在較低水平，表明斑馬魚(yú)機(jī)體一直處于過(guò)度興奮的狀態(tài)。孟昭宇等［34]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三價(jià)砷和五價(jià)砷脅迫下鯉魚(yú)、草魚(yú)等乙酰膽堿酶活性隨砷濃度增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，砷與銻同為第ⅤA族，化學(xué)性質(zhì)相似，對(duì)魚(yú)的作用機(jī)制也可能相似。

3.5 Sb對(duì)斑馬魚(yú)乳酸脫氫酶活性的影響

LDH是在細(xì)胞內(nèi)催化乳酸氧化成丙酮酸的重要酶，當(dāng)機(jī)體各個(gè)組織器官病變或受到損傷時(shí)，其內(nèi)部的LDH就要發(fā)生變化［20，35]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，短時(shí)間內(nèi)各濃度組LDH酶活性均低于對(duì)照組，該研究結(jié)果與陳立偉研究的鎘對(duì)黃顙魚(yú)LDH的影響一致［26]，隨著時(shí)間增加，低濃度組LDH酶活性有所上升，斑馬魚(yú)機(jī)體在銻脅迫下具有更強(qiáng)的催化乳酸生成丙酮酸的能力，這是斑馬魚(yú)對(duì)污染刺激產(chǎn)生適應(yīng)性的一種表現(xiàn)，以增強(qiáng)LDH活性的方式增加機(jī)體的能量代謝，但高濃度組的LDH酶活性仍很低。

3.6 Sb對(duì)斑馬魚(yú)磷酸酶活性的影響

3.6.1 Sb對(duì)ACP活性的影響 ACP是溶酶體的標(biāo)志酶之一，表明溶酶體和其他水解酶的存在，也表明細(xì)胞內(nèi)消化的進(jìn)行［36]，而斑馬魚(yú)可以通過(guò)胞飲作用直接吸收蛋白質(zhì)顆粒然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)消化［37]，ACP還參與免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)，在細(xì)胞損傷和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［38]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，短時(shí)間（24 h）內(nèi)ACP活性濃度降低，通過(guò)胞飲作用吸收的蛋白質(zhì)含量減少，吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，表明銻可以在短期內(nèi)影響斑馬魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隨后ACP活性又迅速升高，是斑馬魚(yú)對(duì)銻脅迫適應(yīng)性的一種表現(xiàn)，可能是因?yàn)榘唏R魚(yú)機(jī)體吸收大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)抵抗銻對(duì)組織器官的損傷，也有可能是因?yàn)殇R脅迫導(dǎo)致斑馬魚(yú)機(jī)體大量細(xì)胞受損，細(xì)胞內(nèi)存在大量的溶酶體和水解酶進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)消化，后期ACP酶活性又降低，表明機(jī)體的調(diào)節(jié)機(jī)制存在極限。

3.6.2 Sb對(duì)AKP活性的影響 AKP主要存在于細(xì)胞膜中，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和離子分泌等過(guò)程，與機(jī)體生長(zhǎng)、免疫防御和消化吸收功能密切相關(guān)［36-38]。實(shí)驗(yàn)表明，短時(shí)間（24 h）高濃度（30、40 mg/L）銻脅迫能促進(jìn)AKP活性，48 h時(shí)不同濃度對(duì)AKP活性也呈促進(jìn)作用，表明其吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，可能是因?yàn)榘唏R魚(yú)為了抵抗銻的毒害作用的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，高濃度下AKP活性降低，可能是機(jī)體的調(diào)節(jié)機(jī)制存在極限。

4 結(jié)論

隨銻脅迫時(shí)間增加，斑馬魚(yú)ATP酶、CAT活性呈先降低后增高的現(xiàn)象，SOD、POD、AchE、LDH和ACP活性呈先降低后增高再降低的變化趨勢(shì)，AKP酶活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。

銻對(duì)斑馬魚(yú)的抗氧化酶系統(tǒng)的影響表現(xiàn)為先抑制后促進(jìn)再抑制，對(duì)興奮傳導(dǎo)、能量代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、機(jī)體生長(zhǎng)和免疫防御等生命過(guò)程的中間環(huán)節(jié)產(chǎn)生一定影響。斑馬魚(yú)可以通過(guò)一系列應(yīng)激反應(yīng)緩解銻對(duì)其的毒性機(jī)制，但其調(diào)節(jié)機(jī)制有一定范圍，由于斑馬魚(yú)與人類基因的高度相似性，類比銻對(duì)人體上述生命過(guò)程也可能有明顯的毒害作用。