聚乙烯醇降解細(xì)菌篩選及其降解特性

劉亞蘭 段夢(mèng)潔 林曉珊 張毅

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510000）

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA），是一種人工合成的白色或微黃色片狀、顆?；蚍勰罟腆w材料。由于其自身存在非常優(yōu)異的水溶性、乳化性、耐油脂性等性能，所以在造紙業(yè)、印染業(yè)、食品包裝、安全玻璃生產(chǎn)等行業(yè)中均得到了大范圍的應(yīng)用，而且每年世界上對(duì)PVA的需求也在不斷增加，產(chǎn)量快速增長(zhǎng)［1]。隨著世界環(huán)境保護(hù)議題的逐漸加深以及可持續(xù)發(fā)展理念的實(shí)行，有必要篩選出具有高效降解PVA的菌株，并研究其降解機(jī)理，使得在不同工業(yè)環(huán)境下產(chǎn)生的PVA廢水或者PVA固態(tài)廢棄物能夠加速降解，以減輕生態(tài)環(huán)境負(fù)荷。

聚乙烯醇是當(dāng)前世界上為數(shù)不多的生物可降解高分子材料，如在真菌和放線菌作用下可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PVA的快速降解，其中以細(xì)菌中的假單胞菌和鞘氨醇單胞菌居多，而假單胞菌是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)最早的可降解PVA的微生物。1973年，Suzuki等［2]在研究中得到了一株能夠?qū)⒕垡蚁┐纪耆到獾木關(guān)seudomonasO-3，自此聚乙烯醇的可生物降解性越來越受到人們的關(guān)注。1983年，Shimao等［3]研究發(fā)現(xiàn)了可以降解聚乙烯醇的微生物菌群，主要分為兩大類，第一類由Pseudomonassp.組成，它們自身能夠分泌出大量可降解聚乙烯醇的酶，其發(fā)揮降解作用需要吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）作為輔助因子，另外鈣離子和鎂離子在酶的作用過程中也起重要作用；第二類則由Pseudomonassp.和Alcaligenessp.共同組成，Alcaligenessp.主要負(fù)責(zé)為Pseudomonassp.的生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子。1999年，Matsumura等［4]在研究中發(fā)現(xiàn)了一株Alcaligenes faecalisKK314，該菌株以聚乙烯醇作為唯一的碳源，它能夠分泌出胞外聚乙烯醇脫氫酶（Polyvinyl alcohol dehydrogenase，PVADH），通過PQQ以及氯化鈣的輔助實(shí)現(xiàn)降解功能。Liu等［5]發(fā)現(xiàn)Bacillus amyloliquefaciens在有一定量酵母粉的搖瓶?jī)?yōu)化條件下，可以更加高效地利用聚乙烯醇。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物對(duì)聚乙烯醇材料的獨(dú)立降解速率仍然較低，有些對(duì)生存環(huán)境的要求也相對(duì)較高［6]。為了加速環(huán)境中廢棄PVA的降解，發(fā)掘新的可快速降解聚乙烯醇降解菌株，并研究其相關(guān)降解特性、探究其降解機(jī)理，是非常有必要的。

影響聚乙烯醇材料生物降解的內(nèi)部因素包括聚乙烯醇材料本身的聚合度和醇解度。通常認(rèn)為，聚乙烯醇材料的聚合度越高，材料所需要的降解時(shí)間就越長(zhǎng)。Corti等［7]學(xué)者發(fā)現(xiàn)PVA的醇解度相比于聚合度對(duì)微生物的降解能力有較大影響，但也有學(xué)者用類產(chǎn)堿假單胞菌降解不同型號(hào)的PVA時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聚合度一定時(shí)，醇解度對(duì)PVA降解率的影響并不明顯［8]。

本研究將PVA泡棉材料經(jīng)過3年的堆肥后，利用Finely法從中篩選出可高效降解PVA的菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察及16S rRNA測(cè)序、進(jìn)化樹分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定；使用紅外光譜分析了不同降解期限內(nèi)PVA泡棉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征；利用紫外分光光度計(jì)每48 h檢測(cè)培養(yǎng)基中PVA的降解率以及菌體OD600，同時(shí)對(duì)比了4株菌對(duì)不同醇解度的PVA的降解速率的影響，旨為PVA降解菌株的應(yīng)用以及聚乙烯醇生物降解機(jī)制研究提供一定的參考理論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品 聚乙烯醇：PVA1788，聚合度 1 700，醇解度88%，灰分含量低于0.7%；PVA1799，聚合度 1 700，醇解度99%，灰分含量低于0.7%，兩者均購(gòu)自臺(tái)灣長(zhǎng)春化工有限公司；聚乙烯醇泡棉：長(zhǎng)15.0 cm、寬10.0 cm、厚度2.0 cm，由PVA1799制成，重量約50.0 g，含水量70%，由臺(tái)灣東海大學(xué)張有義教授提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基g/L：蛋白胨10.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，pH 7.0±0.2。

LB瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，瓊脂15，pH 7.0±0.2。

篩選培養(yǎng)基（g/L）：PVA1799 0.5，NH4NO30.1，K2HPO41.6，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，CaCl20.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，瓊脂 15.0，pH 7.0-7.2。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基1：PVA1788 3.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，其余同篩選培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基2：PVA1799 3.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，其余同篩選培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑及儀器 顯色劑：A：4.0 g/L硼酸溶液；B：KI-I2溶液儲(chǔ)備液：KI 2.5 g/L，I21.27 g/L。革蘭氏染色液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302），天根生化科技（北京）有限公司；PCR 擴(kuò)增相關(guān)試劑，TaKaRa 公司；PCR 儀（Mastercycler X50），德國(guó) Eppendorf 公司；紫外分光光度計(jì) UV-2000，美國(guó)尤尼柯公司；恒溫培養(yǎng)搖床 THZ-300，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)FD-1B-50，上海仙象儀器儀表有限公司；傅里葉紅外光譜儀Nicolet 6700，賽默飛世爾科技分子光譜部；ZEISS掃描電鏡，德國(guó)卡爾蔡司股份公司。

1.1.4 堆肥來源 本研究中的堆肥從君得生物科技有限公司購(gòu)買，主要組成為：雞糞52.02%（W/W），稻草28.45%（W/W），含水率 68%（W/W），pH 6.73。

1.2 方法

1.2.1 PVA泡棉的堆肥實(shí)驗(yàn) 將聚乙烯醇泡棉剪裁成3.5 cm× 2.0 cm× 1.0 cm的小長(zhǎng)方塊樣品若干，置于裝有一定量堆肥的收納箱中，使其均勻分布，總深度大約10.0 cm，隨后將收納箱放在室溫條件下避光存儲(chǔ)［9]。整個(gè)堆肥過程每2 d在其表面噴灑適量無菌水，以保證堆肥的濕度。

1.2.2 PVA降解菌株的篩選分離 取經(jīng)堆肥作用3年的PVA泡棉樣品若干，去掉樣品表面的殘存堆肥，稱量3 g已降解幾近為粉末狀的聚乙烯醇泡棉，置于裝有無菌生理鹽水的錐形瓶中，在37℃、150 r/min條件下震蕩30 min，使材料表面的微生物充分洗脫下來，從中取50 μL 液體接種于篩選培養(yǎng)基平板上，均勻涂布后置于37℃生化箱恒溫培養(yǎng)，待到平板菌落不再增多時(shí)（6 d），挑取平板上的菌落，利用LB培養(yǎng)基進(jìn)行富集。由于定型濾紙片可以使菌體更好地附著在平板上，且有利于直觀查看透明圈效果，故使用直徑約1.5 cm的滅菌濾紙片將LB培養(yǎng)液內(nèi)的菌體接種在篩選培養(yǎng)基平板上，連續(xù)培養(yǎng)6 d，然后對(duì)其開展Finley透明圈實(shí)驗(yàn)，通過觀察透明圈大小判定微生物對(duì)聚乙烯醇的降解能力［10]。對(duì)于產(chǎn)生較大透明圈的菌株，進(jìn)行純化分離及菌株保藏（與甘油混合后，置于-80℃凍存），并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 Finley透明圈實(shí)驗(yàn) 將顯色劑A與顯色劑B進(jìn)行4∶1混合［11]，從中取出3 mL滴加在平板上，輕輕晃動(dòng)使其均勻覆蓋整個(gè)平板，避光處理10 min［12]后觀察顯色結(jié)果。

1.2.4 聚乙烯醇降解菌株的鑒定

1.2.4.1 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)觀察 在LB瓊脂培養(yǎng)基上將4株菌培養(yǎng)12 h后，觀察并記錄菌落形態(tài)，同時(shí)用無菌接種環(huán)在平板上挑取適量菌體進(jìn)行革蘭氏染色。另外取經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h的適量菌液，經(jīng)戊二醛固定、乙醇梯度脫水和臨界點(diǎn)干燥后，進(jìn)行電鏡掃描。

1.2.4.2 細(xì)菌DNA的提取 取在LB培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24 h的菌體培養(yǎng)液10 mL，在6 000 r/min、4℃條件下離心5 min，取沉淀部分，按照細(xì)菌提取試劑盒操作說明進(jìn)行DNA提取。

1.2.4.3 PCR擴(kuò)增 從細(xì)菌16S rDNA片段中選擇V1-V9區(qū)，以通用擴(kuò)增引物實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品DNA的擴(kuò)增 處 理［13]， 以 F27（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）作為上游引物，R1429（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為下游引物。具體操作為：將樣品在94℃條件下預(yù)變性2 min；然后在94℃下繼續(xù)處理30 s；將溫度調(diào)為50℃處理30 s；升溫至72℃處理2 min，按照這個(gè)操作循環(huán)處理30次；最后在72℃條件下延伸10 min。上述處理完成之后，從上述樣品中取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer進(jìn)行混合，上樣置于1% 的瓊脂糖凝膠中，在電壓120 V下電泳處理30 min。電泳結(jié)束后，將凝膠放在3×Gelred核酸染料中染色10 min，最后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)來對(duì)PCR擴(kuò)增效果進(jìn)行驗(yàn)證。

上機(jī)測(cè)序：PCR樣品經(jīng)過純化之后，樣品測(cè)序由廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)得到的DNA序列，通過Blast進(jìn)行比對(duì)，然后下載相似菌株及相鄰物種的DNA序列，通過Clustal W對(duì)比其序列，以MEGA 7.0.26來建立系統(tǒng)發(fā)育樹［14]。

1.2.5 PVA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備［15]：取PVA為5.0 g/L 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過不含PVA的培養(yǎng)基將其進(jìn)行稀釋，得到含PVA為0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 g/L的培養(yǎng)基，將這6個(gè)不同濃度PVA的培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。OD值測(cè)定：將上述標(biāo)液與顯色劑B、A按照2∶2∶6的比例進(jìn)行反應(yīng)［11]，同時(shí)將不含PVA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與KI-I2、硼酸溶液進(jìn)行反應(yīng)作為空白，避光處理15 min，在其最大吸收峰波長(zhǎng)處［PVA1788（495 nm）；PVA1799（500 nm）]測(cè)定上述反應(yīng)液對(duì)應(yīng)的OD值，每組試驗(yàn)平行測(cè)試3次，然后根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，以PVA濃度作為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，得到本次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線［12]。

1.2.6 分離菌株對(duì)PVA1788/99的降解 取各菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液，按1% 接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基1和2中，每48 h對(duì)培養(yǎng)基中PVA濃度、活菌濃度進(jìn)行測(cè)定。搖瓶培養(yǎng)條件均為37℃、150 r/min；活菌濃度在OD600條件下測(cè)定；本文中所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行，并取其平均值。

發(fā)酵液離心：6 000 r/min條件下對(duì)各發(fā)酵液離心5 min，獲取上清液。

OD值測(cè)定：利用1.2.5中OD值的測(cè)定方法來測(cè)定每個(gè)樣品與顯色劑反應(yīng)后的OD值，并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得PVA濃度，經(jīng)公式1-1計(jì)算得PVA的降解率。

其中，C0代表培養(yǎng)基中最初的PVA濃度；Ct代表時(shí)間t時(shí)刻下培養(yǎng)基中PVA的濃度。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析 將堆肥0個(gè)月（初始PVA泡棉）、3個(gè)月、2年、3年的PVA泡棉取出，用無菌水清洗3次，經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)處理12 h。取適量冷凍干燥后的樣品研磨至均勻粉末狀，沾取適量溴化鉀［16]后利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試范圍為400-4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

2 結(jié)果

2.1 PVA降解菌株的分離鑒定

2.1.1 透明圈產(chǎn)生結(jié)果 圖1顯示的是各菌株在篩選培養(yǎng)基中形成的透明圈，相同培養(yǎng)條件下，形成的透明圈尺寸較大且界面清晰，可初步說明該菌株具有較好的PVA降解能力。

2.1.2 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察 在LB瓊脂培養(yǎng)基上將4株菌培養(yǎng)12 h后，DG01的菌落直徑大小約為8.9 mm，DG02的菌落直徑大小約為12.2 mm，且兩者的菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，即菌落中心較濕潤(rùn)，邊緣較整齊且干燥，菌落呈米黃色，表面有明顯的細(xì)絲狀痕跡；DG03和DG04的菌落直徑約為1 mm，菌落邊緣整齊，半透明，有明顯的光澤，乳白色。

圖1 各篩選菌株產(chǎn)生的透明圈

根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果，DG01、DG02均屬于革蘭氏陽(yáng)性桿菌，DG03、DG04為革蘭氏陰性桿菌。由掃描電鏡圖（圖2）可看出，DG01與DG02菌體為橢圓棒狀，大小分別約為1.36 μm×2.50 μm和1.40 μm×3.20 μm；DG03和DG04菌體為長(zhǎng)桿狀，大小分別約為 0.83 μm×2.70 μm 和 0.90 μm×2.85 μm。

2.1.3 微 生 物16S rRNA鑒 定 結(jié) 果 在DG01、DG02、DG03和DG04菌株中，其16S rDNA片段長(zhǎng)度依次為1 384、1 355、1 340和1 381 bp，非常接近一般的16S rDNA長(zhǎng)度（1 540 bp），這也充分說明了測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性。進(jìn)一步經(jīng)過Blast序列比對(duì)可知，DG01、DG02、DG03和DG04依次與Bacillus thuringiensisBM-BT15426、Bacillus thuringiensisBMBT15426、Paenibacillus pabuliSW12、Paenibacillus pabuliSW12的同源性達(dá)到100%。以Clustal W來比對(duì)下載的相似菌株及相鄰物種DNA序列，并通過MEGA 7.0.26來建造系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示?？沙醪酱_定DG01、DG02菌株為Bacillussp.DG01（Accession No.MK208524）、Bacillussp. DG02（Accession No.MK208525），DG03、DG04菌 株 為Paenibacillussp. DG03（Accession No.MK208526）、Paenibacillussp. DG04（Accession No.MK208527）。

2.2 PVA泡棉的紅外表征

本實(shí)驗(yàn)使用紅外技術(shù)對(duì)經(jīng)過不同堆肥時(shí)期的PVA泡棉進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，堆肥3個(gè)月與初始PVA泡棉在特征區(qū)及指紋區(qū)產(chǎn)生峰的位點(diǎn)大致相同，因此可知聚乙烯醇泡棉的分子結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化。通過分析堆肥2年的PVA泡棉紅外圖譜可知，圖譜中沒有了甲基基團(tuán)，而在2 780.94 cm-1處存在一較強(qiáng)的峰，在1 720.54 cm-1，1 411.15 cm-1，1 241.56 cm-1處 也 有較強(qiáng)的吸收峰，說明其中存在羧基；另外，指紋區(qū)在691.30 cm-1處出現(xiàn)了較強(qiáng)峰，表明堆肥在降解的過程中形成了新的羥基。觀察降解3年材料的紅外光譜可發(fā)現(xiàn)，在2 780.74 cm-1處有一強(qiáng)烈峰，對(duì)應(yīng)指紋區(qū)在1 719.43 cm-1，1 419.30 cm-1，1 236.27 cm-1處存在較強(qiáng)峰，表明系統(tǒng)中存在羧基；同時(shí)在690.26 cm-1處存在較強(qiáng)峰，說明也產(chǎn)生了新的羥基。

圖2 各篩選菌株的掃描電鏡結(jié)果

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 分離菌株對(duì)PVA1788/99的降解

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用1.9中PVA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法后，得到PVA1788溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y1=0.15X1+0.018，R2=99.79%， 方 程 中X1代表 PVA1788濃 度，Y1為 OD值，PVA1788濃 度與λ=495 nm處各標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液OD值呈良好的線性關(guān)系；得到PVA1799溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y2=0.22X2+0.018，R2=99.65%，PVA1799濃 度 與λ=500 nm處各標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液OD值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 PVA1788/99的降解與菌體生長(zhǎng)關(guān)系 圖5顯示的是四株細(xì)菌對(duì)PVA1788/99的降解率及菌體濃度變化曲線。在8 d的降解過程中，DG01、DG02、DG03和DG04對(duì)PVA1799的降解率依次為58.27%、54.47%、43.32%和46.59%，對(duì)PVA1788的降解率分別達(dá)到67.27%、74.99%、56.74%和59.7%。四株菌對(duì)PVA1788降解率明顯高于對(duì)PVA1799的降解率，說明低醇解度的PVA更有利于微生物的降解。從圖5-B、5-D可以看出，在0-2 d，PVA1799基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)活菌濃度增長(zhǎng)最快，對(duì)應(yīng)的PVA1799的降解速率也達(dá)到最快，說明各菌株對(duì)PVA1799的降解能力主要受到菌體增殖速率的影響；從圖5-A、5-C可以看出，在0-2 d，DG01、DG02和DG04處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，對(duì)應(yīng)的PVA1788降解速率最快，DG03菌體的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)區(qū)間是在0-4 d，其對(duì)應(yīng)的PVA1788降解速率上升區(qū)間也是在0-4 d，說明了PVA1788消耗和菌體的個(gè)體生長(zhǎng)也呈相關(guān)關(guān)系。另外，圖5-B、5-D顯示，在2-8 d時(shí)，當(dāng)PVA1799基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的活菌濃度有所下降直至穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，PVA1799的降解速率也開始下降并逐漸趨于穩(wěn)定；從圖5-A、5-C可看出，在2-8 d時(shí)，DG01、DG02和DG04的菌體濃度趨于穩(wěn)定，PVA1788的降解速率曲線也趨于平緩，而DG03的菌體濃度穩(wěn)定時(shí)期和PVA1788的降解速率趨穩(wěn)時(shí)期則是4-8 d。以上結(jié)果表明，對(duì)于PVA1788/99的降解，4株菌的菌體生長(zhǎng)與PVA1788/99的降解率變化趨勢(shì)密切相關(guān)；除DG03對(duì)PVA1788的降解率增長(zhǎng)區(qū)間在0-4 d外，其余3株菌對(duì)PVA的降解率最快時(shí)期和自身增長(zhǎng)對(duì)數(shù)期都在0-2 d。此外，從菌種屬來看，屬于Bacillussp.的DG01和DG02對(duì)PVA1788/99的降解率要普遍高于屬于Paenibacillussp.的DG03和DG04。

圖4 不同堆肥期中PVA泡棉材料的紅外吸收比對(duì)圖

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的能夠降解PVA材料的菌株主要分布于Pseudomonas，而屬于Bacillus及Paenibacillus的只有少數(shù)，根據(jù)學(xué)者 Chio等［17]的研究可知，通過將Microbacterium barkeriKCCM10507與Paenibacillus amylolyticusKCCM10508兩種菌株按照一定的比例進(jìn)行混合，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)污水中聚乙烯醇的快速降解。另外，Mori等［18]在1996年從污泥中分離到一株Bacillus megaterium，其必須在與PN19共同培養(yǎng)的情況下才能降解聚乙烯醇。本研究通過3年的實(shí)驗(yàn)室條件堆肥之后，利用以PVA1799為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從已降解的PVA泡棉材料中篩選出了可獨(dú)立降解PVA的高效菌株，該菌株在8 d內(nèi)對(duì)3 g/L PVA的降解率最高可達(dá)74.99%，且不需要添加PQQ、金屬離子等促生長(zhǎng)因子，可獨(dú)立進(jìn)行PVA代謝，具有一定的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。

紅外光譜圖可用于研究分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，由物質(zhì)分析得到的紅外譜圖可反映出物質(zhì)所含的官能團(tuán)種類，結(jié)合特征譜和指紋區(qū)的分析即用來表征和鑒別化合物。經(jīng)過3年的堆肥后，PVA泡棉已由原來的塊狀變?yōu)閹捉勰?，另有少量碎塊。在實(shí)驗(yàn)所得的紅外圖譜中發(fā)現(xiàn)，相比堆肥3個(gè)月的PVA泡棉與原始PVA泡棉材料，兩者在特征區(qū)及指紋區(qū)產(chǎn)生峰的位點(diǎn)比較相似，這就意味著堆肥前后材料的分子結(jié)構(gòu)不會(huì)出現(xiàn)明顯的改變，繼而說明短時(shí)間的堆肥對(duì)PVA泡棉的影響作用不大，可對(duì)其產(chǎn)生降解作用的微生物可能還未富集到能對(duì)PVA泡棉產(chǎn)生明顯降解作用的程度。而經(jīng)過2年和3年堆肥期的PVA泡棉材料的紅外圖譜顯示，甲基基團(tuán)消失，同時(shí)伴隨著新的羧基和羥基的產(chǎn)生，Chen等［19]學(xué)者在研究混菌對(duì)PVA1799的降解作用時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了降解后的PVA1799出現(xiàn)了新的羥基等基團(tuán)。新的官能團(tuán)的出現(xiàn)，說明PVA泡棉分子結(jié)構(gòu)的改變，繼而說明微生物菌體對(duì)其產(chǎn)生了降解作用。

在PVA1788/99的降解研究過程中，所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基僅以PVA作為碳源，未添加其他的碳源物質(zhì)，因此4株菌只能夠利用PVA為碳源來滿足自身生長(zhǎng)及代謝需求。由PVA降解速率與菌體濃度變化曲線圖分析可知，PVA材料的降解與菌體的生長(zhǎng)、增殖過程存在著緊密的聯(lián)系。在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基中的PVA濃度較高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，此時(shí)菌體生長(zhǎng)較快，對(duì)PVA的代謝也比較旺盛，降解速率最快；而在菌體生長(zhǎng)平臺(tái)期，菌體的增長(zhǎng)率降低，PVA的代謝速率隨之減慢。從圖5可看出，PVA1788/99的降解率在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期時(shí)已達(dá)成近2/3，剩下的1/3則是在菌體生長(zhǎng)平臺(tái)期達(dá)成，可見菌體生長(zhǎng)平臺(tái)期時(shí)PVA降解效率明顯低于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。此外，當(dāng)PVA的聚合度同為1 700時(shí)，篩選出的4株細(xì)菌對(duì)PVA1788和PVA1799的降解效果顯著不同，說明醇解度在一定程度上影響到PVA的降解效果。在研究中得到的菌株Bacillussp.DG01、Bacillussp.DG02、Paenibacillussp.DG03、Paenibacillussp.DG04對(duì)PVA1788的降解速率整體上比PVA1799快，說明在聚合度一定時(shí)，較低醇解度的PVA更易被微生物分解利用。

圖5 篩選菌株及菌株濃度變化及菌株對(duì)PVA1788/99降解率的影響

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的PVA降解機(jī)制為［20]：PVA長(zhǎng)鏈上兩個(gè)相鄰羥基發(fā)生脫氫反應(yīng)生成氧化型PVA，接著氧化型PVA的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)再被水解為短鏈，短鏈再發(fā)生脫氫，再經(jīng)水解為更短的短鏈，不斷循環(huán)，最終生成CO2和H2O，在此降解過程中，可產(chǎn)生乙酸和甲基酮類物質(zhì)［21-22]。結(jié)合菌體生長(zhǎng)曲線及PVA的降解率情況及紅外圖譜，作者推測(cè)，菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)通過自身分泌的酶將PVA長(zhǎng)鏈切割為短鏈進(jìn)而利用，但隨著短鏈的不斷循環(huán)切割，原來以1，3-二醇鍵形式連接在主鏈上的羥基可能以新的鍵型出現(xiàn)，并在碳原子上連接了新的羧基或者其他基團(tuán)，而菌體對(duì)新的羥基和羧基等基團(tuán)的適應(yīng)性不夠，或者自身分泌的酶無法對(duì)這些新的基團(tuán)再進(jìn)行作用，所以菌體的生長(zhǎng)受到限制。要使菌體生長(zhǎng)代謝進(jìn)一步提高，可嘗試對(duì)菌體進(jìn)行長(zhǎng)期馴化使其能夠利用不同類型的PVA的切割短鏈。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)堆肥實(shí)驗(yàn)，篩選出了4株具有獨(dú)立降解PVA1788/99效果的細(xì)菌，即Bacillussp.DG01（Accession No.MK208524）、Bacillussp. DG02（Accession No.MK208525）、Paenibacillussp. DG03（Accession No.MK208526）、Paenibacillussp. DG04（Accession No.MK208527）。4株細(xì)菌對(duì)低醇解度的PVA1788的降解率要高于PVA1799，菌體的生長(zhǎng)代謝與PVA降解率的變化密切相關(guān)。經(jīng)過2年、3年堆肥，PVA泡棉原來的甲基消失，產(chǎn)生了新的羥基和羧基。

致謝：

本實(shí)驗(yàn)中所用的聚乙烯醇泡棉材料由中國(guó)臺(tái)灣東海大學(xué)張有義教授提供，在此表示衷心的感謝。