兩種地衣共生藻對(duì)銅和鋅的耐受性及吸附特性研究

吉米拉木·加馬力 美合日班·阿不力米提 古海尼沙·買買提艾尼瓦爾·吐米爾

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

自然環(huán)境中銅和鋅元素對(duì)生物起著雙重作用。鋅是各種藻類生長(zhǎng)代謝的重要微量元素［1-2]，但是高濃度的鋅離子通過(guò)抑制細(xì)胞分裂、影響光合作用等方式抑制藻類的生長(zhǎng)，從而使得葉綠素含量下降［1]。鋅離子在水溶液中的濃度達(dá)到1.0-1.4 mg/L時(shí)，導(dǎo)致藻類的直接死亡［3]。低濃度銅是藻類代謝過(guò)程中必不可少的，但高濃度銅對(duì)藻類具有毒害性。銅對(duì)細(xì)胞代謝具有極強(qiáng)的抑制作用，故在生產(chǎn)生活中常把硫酸銅配成殺藻劑，有效控制水環(huán)境藻類的大量生長(zhǎng)［4]。

隨著農(nóng)業(yè)、工業(yè)等的不斷發(fā)展，汞、鎘、鉛、鎳、銅、鋅等重金屬污染對(duì)水生態(tài)環(huán)境、生物生存及人類健康造成威脅，已成為人類面臨解決的迫切難題之一。如今，多種生物體包括細(xì)菌、真菌、酵母、藻類以及大型植物等作為生物吸附劑，被用來(lái)吸附水環(huán)境中的重金屬。與其他生物吸附劑相比，藻類對(duì)諸多重金屬具有很好的吸附能力，資源豐富，不僅是水體重金屬污染檢測(cè)劑，更重要的作用是作為生物吸附劑，可以廣泛地應(yīng)用在已被重金屬污染并且其他的生物都很難以生存的水體的改造。1949年Ruchhoft等首次提出了“生物吸附”的概念［5]；1988年，Gekeler等［6]研究指出，藻類能夠通過(guò)合成螯合肽復(fù)合物與重金屬結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)小球藻合成的螯合肽復(fù)合物可以結(jié)合Cu、Pb、Zn、Ag和Hg等多種重金屬；2001年，浩云濤等［7]通過(guò)分離篩選得到的具高重金屬抗性橢圓小球藻（Chlorellae elipsoidea）來(lái)研究其對(duì)不同濃度的Cu2+、Cd2+、Ni2+和Zn2+的吸收富集能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小球藻對(duì)4種重金屬有較高的去除能力，去除率分別達(dá)到40.93%、98.33%、97.62%和86.88%；2010年，吳海一等研究指出：鼠尾藻對(duì)Zn2+和Cd2+的富集能力較強(qiáng)，修復(fù)重金屬污染的海洋水環(huán)境時(shí)，尤其是鋅的污染，可以利用鼠尾藻［8]。2011年，薛培英等［9]以黑藻為吸附劑，對(duì)重金屬進(jìn)行吸附研究，結(jié)果顯示黑藻對(duì)Cu2+的最大吸附容量為42.86 mg/g，去除率達(dá)70%；2011年，Zakhama等［10]研究報(bào)道，石莼對(duì)Cu2+、Pb2+、Cd2+和Ni2+的吸附量分別為112 mg/g、230 mg/g、127 mg/g和 67 mg/g，石莼能有效地去除水環(huán)境中部分重金屬離子。在國(guó)內(nèi)，2015 年熱依拉等［11]研究指出，不同濃度（1-4 mmol/L）Cu2+處理對(duì)地卷共生藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的影響，在所有處理?xiàng)l件下，地卷共生藻細(xì)胞壁、細(xì)胞膜均完整，且大多數(shù)共生藻細(xì)胞處于分裂狀態(tài)。有些地卷共生藻及其內(nèi)生真菌可能本身就具有對(duì)Cu2+、Zn2+等重金屬離子的耐性，在地衣共生藻抗重金屬Cu2+、Zn2+脅迫中與共生菌可能同等重要［12-15]。

為了深入了解地卷共生藻響應(yīng)重金屬Cu2+、Zn2+脅迫的耐受性吸附特性和地衣共生藻在水體重金屬污染修復(fù)中是否存在一定的優(yōu)勢(shì)，本研究以2種地衣共生藻為研究對(duì)象，在 Cu2+、Zn2+脅迫下，研究地衣共生藻對(duì)Cu2+、Zn2+的吸附性，為進(jìn)一步探討地衣共生內(nèi)藻在水體中重金屬污染生物修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從兩種地衣體即平盤軟地卷（Peltigera elisabethae），犬地卷（Peltigera canina）內(nèi)分離培養(yǎng)的地衣共生藻（2種桿裂絲藻）分別命名為：B和P.E。

地衣標(biāo)本：2014 年 10 月采集于烏魯木齊米泉林場(chǎng)哈熊溝，海拔高度為 1 960-2 100 m，-20℃保存。

1.2 方法

以分離純化的兩種地衣共生藻（B、P.E）為實(shí)驗(yàn)材料，配制含重金屬BG-11液體培養(yǎng)基及藻株懸浮液，Cu2+（20、40、60、80、100 mg/L），Zn2+（100、200、300、400、500 mg/L）對(duì)2種地衣共生藻進(jìn)行培養(yǎng)12 d，隔3 d對(duì)各種指標(biāo)（細(xì)胞活率，重金屬吸附特性）進(jìn)行一次測(cè)定。

1.2.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定 細(xì)胞存活率的測(cè)定：采用伊文斯藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率［16]，進(jìn)一步用半數(shù)致死濃度計(jì)算方法［17]來(lái)計(jì)算并分析細(xì)胞半致死濃度（LC50）。

Cu2+、Zn2+的吸附特性：配制含重金屬BG-11液體培養(yǎng)基及藻株懸浮液，對(duì)5種地衣體藻進(jìn)行培養(yǎng)6 d，并通過(guò)離心（8 000 r/min，10 min），去除上清液用于測(cè)定培養(yǎng)液重金屬含量。將收集的藻體用5 mL 的 20 mmol/L Na2-EDTA 反復(fù)沖洗 10 min，然后用 5 mL的去離子水沖洗10 min，2次沖洗的溶液混合在一起用吸附于細(xì)胞表面的重金屬含量測(cè)定。采用BCO分光光度法測(cè)定銅含量［18]，雙硫腙分光光度法測(cè)定鋅含量［19]。，并按照公式計(jì)算藻細(xì)胞對(duì)重金屬的去除率：Q=（C0- C1-C2）/C0×100%。

公式中：Q為藻細(xì)胞對(duì)重金屬的去除率，C0為培養(yǎng)液中的重金屬初始濃度，C1為培養(yǎng)期結(jié)束后培養(yǎng)液中的重金屬含量，C2為細(xì)胞表面沖洗取得重金屬含量。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 2010 及 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與方差分析和多重比較（0.05 和 0.01水平）。

2 結(jié)果

2.1 Cu2+脅迫對(duì)2種地衣共生藻細(xì)胞活率的影響

通過(guò)伊文思藍(lán)染色劑檢測(cè)地衣共生藻的死亡，死亡細(xì)胞著色深藍(lán)色，而活細(xì)胞不著色（綠色），可明顯地區(qū)別活細(xì)胞和死亡細(xì)胞，是一種簡(jiǎn)便、直觀的檢測(cè)方法（圖1）。

圖1 兩種地衣共生藻伊文斯蘭染色結(jié)果圖（10×40）

如圖2所示，在不同濃度脅迫下（0-100 mg/L），2種地衣共生藻（B、P.E），隨著 Cu2+濃度的提高及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（0，3，6，9，12 d），2種地衣共生藻B與P.E細(xì)胞存活率均逐步下降（P＜0.01），但具有一定的差異。

較低的Cu2+脅迫下（≤60 mg/L時(shí)），2種地衣共生藻均保留著較高的細(xì)胞活力，培養(yǎng)至12d時(shí)，仍然存活一半多的細(xì)胞，Cu2+脅迫對(duì)2種地衣共生藻的毒性作用較低；隨著Cu2+濃度的加劇，共生藻細(xì)胞的活力明顯梯度式降低，當(dāng)Cu2+脅迫100 mg/L時(shí)，地衣共生藻P.E培養(yǎng)至第6d，56.66%的藻細(xì)胞可存活，但是培養(yǎng)至9 d、12 d時(shí)，藻細(xì)胞基本都死亡（32.48%、10.43%）；地衣共生藻B培養(yǎng)初期（3 d）細(xì)胞活力較明顯的下降，達(dá)12d時(shí)，只有 6.43%細(xì)胞可存活，幾乎沒(méi)有生存的細(xì)胞。結(jié)果表明，較高濃度Cu2+脅迫（80-100 mg/L），對(duì)2種地衣共生藻的影響均較顯著，但是各濃度脅迫下，地衣共生藻P.E的細(xì)胞活力均高于B，對(duì)Cu2+脅迫有較高的耐性。

圖2 不同濃度Cu2+脅迫對(duì)2種藻細(xì)胞活率的影響

2.2 Zn2+脅迫對(duì)兩種地衣共生藻細(xì)胞活率的影響

如圖3所示，不同濃度的Zn2+（0-500 mg/L）脅迫下，2種共生藻B和P.E的細(xì)胞存活率與隨著脅迫濃度及培養(yǎng)時(shí)間呈反相關(guān)，即隨著脅迫濃度的提高及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步下降趨勢(shì)（P＜0.01），但變化趨勢(shì)存在一定的差異。

較低濃度Zn2+（≤200 mg/L）脅迫下，2種地衣共生藻細(xì)胞均保留著較高的活力，并且較穩(wěn)定（細(xì)胞活力＞80%）；當(dāng)Zn2+濃度300 mg/L培養(yǎng)第12天時(shí)，地衣共生藻B細(xì)胞存活率為61.49%，仍然保留著較高的細(xì)胞活力，P.E 的細(xì)胞活率分為49.99%（接近50%）；較高濃度的Zn2+脅迫（＞300 mg/L）對(duì)兩種藻的影響較大，均出現(xiàn)明顯的梯度式下降；當(dāng)Zn2+濃度500 mg/L培養(yǎng)第12天時(shí)，2種共生藻B和P.E的細(xì)胞存活率分別為38.25%和26.47%，細(xì)胞基本死亡。

計(jì)算半致死濃度（LC50）來(lái)確定對(duì)重金屬的耐受性是一種可靠并且方便快捷的方法。為了比較2種地卷共生藻對(duì)Cu2+、Zn2+的耐受性，基于2種重金屬脅迫對(duì)細(xì)胞存活率的影響，進(jìn)一步計(jì)算并分析3種地衣共生藻在不同濃度Cu2+、Zn2+脅迫下的半致死濃度。結(jié)果（表1）表明，Cu2+、Zn2+脅迫下，2種地衣共生藻半致死濃度均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步下降（P＜0.01）；不同重金屬脅迫下，2種地衣共生藻對(duì)Zn2+的LC50均高于Cu2+，說(shuō)明2種地衣共生藻對(duì)Zn2+的耐性均高于Cu2+；在Cu2+脅迫下，地衣共生藻P.E各培養(yǎng)時(shí)期的LC50均高于B，地衣共生藻P.E對(duì)銅的耐受性高于B；Zn2+脅迫時(shí)，前段培養(yǎng)時(shí)間（3-9 d），地衣共生藻P.E對(duì)Zn2+脅迫有較高的耐性，但培養(yǎng)12 d時(shí)，半致死濃度急劇下降并低于B，時(shí)間對(duì)衣共生藻P.E的影響較大。

圖3 不同濃度Zn2+脅迫對(duì)2種藻細(xì)胞活率的影響

2.3 兩種地衣共生藻對(duì)Cu2+吸附特性研究

雙環(huán)己酮草酰二腙（BCO）溶液中Cu2+濃度在波長(zhǎng)（λ610nm）處與吸光度有良好的線性關(guān)系，以Cu2+濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.0955x-0.0065，相關(guān)系數(shù)為0.9995。

細(xì)胞內(nèi)（表2），在不同濃度Cu2+脅迫下，2種地衣共生藻所吸附的銅含量與Cu2+脅迫濃度呈正相關(guān)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增加（P＜0.01），但吸附量有所差異；各濃度Cu2+脅迫下（0-120 mg/L），地衣共生藻P.E在不同時(shí)間內(nèi)所吸附的銅含量均高于B。

表1 兩種地衣共生藻在Cu2+，Zn2+脅迫的半致死濃度（LC50）（mg·L-1）

表2 不同Cu2+濃度脅迫下2種地衣共生藻細(xì)胞內(nèi)銅含量的變化

細(xì)胞外（表3），在不同濃度Cu2+脅迫下，藻培養(yǎng)液的銅含量變化有所差異卻不同；當(dāng)Cu2+脅迫下培養(yǎng)3 d時(shí)，2種地衣共生藻B和P.E培養(yǎng)液的銅含量隨著脅迫濃度的提高呈先增加后下降趨勢(shì)（P＜0.01），當(dāng)Cu2+濃度100 mg/L時(shí)，兩種地衣共生藻對(duì)培養(yǎng)液Cu2+的去除率分別為88.61%和92.35%；培養(yǎng)第6天時(shí)，隨著脅迫濃度的提高而增加（P＜0.01），但對(duì)Cu2+去除率有所下降，當(dāng)Cu2+濃度100 mg/L時(shí)，B和P.E對(duì)Cu2+去除率為85.67%，84.23%。

表3 不同Cu2+濃度脅迫下2種地衣共生藻培養(yǎng)液銅含量的變化

2.4 兩種地衣共生藻對(duì)Zn2+吸附特性研究

雙硫腙-吐溫80溶液中波長(zhǎng)（λ525nm）處的吸光度與Zn2+濃度具有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.0516x-0.0015，相關(guān)系數(shù)為0.9979。

細(xì)胞內(nèi)（表4），不同濃度的Zn2+脅迫下，隨著脅迫濃度的提高，2種地衣共生藻細(xì)胞所吸附的鋅含量逐步增加（P＜0.01）；各濃度Zn2+脅迫下（0-500 mg/L），地衣共生藻P.E在不同時(shí)間內(nèi)所吸附的銅含量均高于B，但地衣共生藻B所吸附的鋅含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，地衣共生藻P.E則相反，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，時(shí)間對(duì)衣共生藻P.E的影響較大。

細(xì)胞外（表5），Zn2+脅迫下培養(yǎng)3d時(shí)，隨著脅迫濃度的增加，培養(yǎng)液鋅含量及2種地衣共生藻對(duì)Zn2+的去除率逐步增加（P＜0.01），去除率分別為95.11%，95.05%，幾乎相等；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（6d時(shí)），Zn2+濃度≤300 mg/L時(shí)，培養(yǎng)液的鋅含量逐步增加，≥400 mg/L時(shí)差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)Zn2+濃度 500 mg/L，B和P.E對(duì)Zn2+的去除率為95.10%，92.23%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)地衣共生藻P.E對(duì)Zn2+吸附量有所下降，與地衣共生藻B幾乎相等。

表4 不同Zn2+濃度脅迫下2種地衣共生藻細(xì)胞內(nèi)鋅含量的變化

表5 不同Zn2+濃度脅迫下2種地衣共生藻培養(yǎng)液鋅含量的變化

3 討論

近年來(lái)有很多研究者利用水生生物來(lái)測(cè)定污染物在水中對(duì)生命體的毒性，而利用自由生長(zhǎng)藻類來(lái)研究污染物的毒性及污染物的吸附性。藻中所含重金屬的水平反映了藻類對(duì)水環(huán)境中重金屬的生物利用率和對(duì)重金屬的耐受性及吸附能力［20]。藻類與重金屬離子有極強(qiáng)的親和性，大多數(shù)研究聚焦于藻類對(duì)重金屬離子的吸附特性［21-26]，其機(jī)理包括絡(luò)合、螯合、離子交換、轉(zhuǎn)化、吸收和微沉淀等；金屬陽(yáng)離子可被細(xì)胞表面的負(fù)電荷位點(diǎn)所吸附細(xì)胞原生質(zhì)膜外有明顯的細(xì)胞壁，其在微生物吸附重金屬離子的過(guò)程中起著重要作用，它是阻止金屬離子進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生毒害的第一道屏障，并且不同藻類相對(duì)于不同重金屬離子具有不同的耐性及吸附性。許多研究表明一些來(lái)自地衣體的藻類對(duì)重金屬具有較高的耐受性及吸附特性。例如，2003年，Ba?kor 等發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的地衣共生藻在4 mmol/L Cu2+脅迫下仍能正常生長(zhǎng)，對(duì)銅具有較高的耐性［27]；álvarez等［28]也發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)的地衣共生藻Trebouxia在100 μmol/L Pb2+脅迫下，對(duì)鉛有較高的吸附性。

為了探討來(lái)自地衣體的藻類對(duì)不同重金屬的耐受性及吸附特性，本研究以來(lái)自不同地卷屬地衣的兩種共生綠藻為研究對(duì)象，在不同濃度的銅和鋅脅迫下處理不同時(shí)間，研究吸附于地衣共生藻細(xì)胞內(nèi)外所吸收的銅、鋅含量與細(xì)胞活力的影響，以確定2種地衣共生藻對(duì)銅和鋅的耐受性與其銅吸附性差異及相關(guān)性。研究結(jié)果表明，2種地衣共生藻雖然屬于同一個(gè)屬，但對(duì)不同重金屬的耐性及吸附性是有差異的；Cu2+對(duì)2種地衣共生藻的毒性作用高于Zn2+，對(duì)Zn2+的吸附性均高于 Cu2+，并且當(dāng)不同濃度的Cu2+、Zn2+脅迫（3 d，6 d）時(shí)，地衣共生藻P.E的細(xì)胞活力及吸附率均高于B；可見(jiàn)地衣共生藻細(xì)胞活力與吸附性是有聯(lián)系的，并呈正相關(guān)性。因此，研究2種地衣共生藻吸附于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外Cu2+、Zn2+含量的變化及吸附能力的差異，可為解釋地衣共生藻在響應(yīng)重金屬Cu2+、Zn2+脅迫時(shí)各自的作用或協(xié)同作用及其機(jī)制提供可參考的寶貴參考資料。

4 結(jié)論

（1）Cu2+、Zn2+是植物生長(zhǎng)的必需元素，但在高脅迫濃度下，2種地衣共生藻對(duì)Zn2+耐受性及吸附性明顯高于Cu2+，而且2種地衣共生藻對(duì)重金屬的耐受性與對(duì)重金屬的吸附性呈正相關(guān)性。

（2）來(lái)自菌藻共生的特殊生物-地卷屬地衣的2種共生藻，相比一些自由生長(zhǎng)藻類對(duì)銅和鋅具有較高的耐受性和吸附特性，在水體重金屬污染修復(fù)中是存在一定的優(yōu)勢(shì)，可進(jìn)一步做一個(gè)良好的生物吸附劑材料。因此，本研究結(jié)果加深探討環(huán)境重金屬Cu2+、Zn2+污染的生物修復(fù)中地衣共生藻作為候選生物資源應(yīng)用的可行性。