四川不同地區(qū)濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)比較

吳樹坤，謝 軍，衛(wèi)春會，劉燕梅，黃治國，萬世旅，鄧 杰,*

（1.四川理工學(xué)院 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；2.宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 宜賓 644000）

“曲乃酒之骨”，好曲是生產(chǎn)出好酒的重要前提之一。大曲制作采用的自然接種和開放式發(fā)酵的生產(chǎn)工藝使其充分網(wǎng)羅了制曲環(huán)境中的微生物，微生物在曲坯中彼消此長，并形成獨(dú)特的群落結(jié)構(gòu)，自然積溫轉(zhuǎn)化并風(fēng)干而成的一種多酶多菌多物質(zhì)的微生物生態(tài)制品，具有糖化發(fā)酵生香的作用，對白酒生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。大曲中的主要菌群為真菌和細(xì)菌，同時(shí)含有少量古菌[1]，不同的微生物各司其職，對白酒的釀造也起著不同的作用，如：霉菌為糖化動力、酵母菌為發(fā)酵動力、細(xì)菌為生香動力[2]。

目前，關(guān)于大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較多。張會敏等[3]通過構(gòu)建16S rDNA克隆文庫的非培養(yǎng)方法對古井貢酒中溫大曲和高溫大曲進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性研究，發(fā)現(xiàn)高溫放線菌（Thermoactinomyces sanguinis）為古井高溫大曲的優(yōu)勢菌且只存在于高溫大曲中；中溫大曲優(yōu)勢菌屬為枝芽孢菌屬（Virgibacillus sp.）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等類群。夏玙等[4]探究了熱風(fēng)干燥工藝對貯存期大曲中真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢真菌類群均為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida），其中嗜熱子囊菌屬在大曲真菌群落中具有明顯的優(yōu)勢。施思等[5]通過高通量測序?qū)Υ笄谫A藏過程中微生物多樣性的變化進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯存過程中大曲真菌群落結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，畢赤酵母屬、根霉菌屬及橫梗霉屬成為最終的優(yōu)勢菌群。本實(shí)驗(yàn)將利用高通量測序技術(shù)研究四川不同地區(qū)濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，為探索不同地區(qū)不同工藝濃香型白酒的差異提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品均為入庫貯存3 個(gè)月的成品曲，分別取自四川宜賓（最高品溫60 ℃）、瀘州（最高品溫58 ℃）和遂寧（最高品溫均為55 ℃），每組樣品隨機(jī)取3 個(gè)平行樣本，將采集的樣品進(jìn)行等量混合后提取DNA。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）成都科龍化工試劑廠；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）-Na2、十六烷基三甲基溴化銨（cetrimonium bromide，CTAB）（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、JY-SP-C型水平電泳槽、ChemiDoc XRS+型水平電泳儀 美國Bio-Rad公司；Lynx6000型高效落地高速離心機(jī)、超低溫冰箱 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取

目前抽提DNA的方法較多且比較完善，其關(guān)鍵均在于微生物的破壁及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的沉淀。本實(shí)驗(yàn)利用改良的CTAB[6]法提取大曲中微生物的總DNA。步驟如下：1）稱取5 g大曲樣品于50 mL無菌離心管中，加入13.5 mL配制好的DNA抽提液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L Na2EDTA、100 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液、1.5 mol/L NaCl、2% CTAB；pH 8.0）于旋渦振蕩器上混勻。2）加入1.5 mL 20% SDS溶液（pH 7.2），于65 ℃水浴2 h，每間隔15 min輕搖顛倒。3）常溫6 000×g離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入新的50 mL離心管中。4）向剩余的沉淀中加入4.5 mL DNA抽提液，0.5 mL 20% SDS，混勻，65 ℃水浴10 min后常溫6 000×g離心10 min。5）合并上清液后加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液混勻，振蕩混勻，靜置10 min，12 000×g常溫離心15 min。6）將上層水相轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入0.6 倍體積異丙醇，混勻，室溫沉淀2 h。7）12 000×g室溫離心15 min，棄上清液，收集沉淀。8）轉(zhuǎn)移沉淀至2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇進(jìn)行洗滌，12 000×g離心5 min，棄上清液；重復(fù)此步驟1 次。9）將離心管置于超凈臺吹風(fēng)干燥，直至無乙醇味。10）向離心管中加入200 μL無菌雙蒸水使DNA沉淀溶解，貯于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物接頭設(shè)計(jì)

根據(jù)Illumina MiSeq測序平臺對引物的要求，針對細(xì)菌16S V3-V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)序列，設(shè)計(jì)帶接頭的特異引物，不同的DNA用對應(yīng)的barcode[7]進(jìn)行標(biāo)記，PCR基于雙端測序，其引物設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)為：5′-miseq接頭A—barcode A—正向測序引物—正向特異引物—3’；5’-miseq接頭B—barcode B—反向測序引物—反向特異引物—3’；細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)的通用引物為：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAG-3’）；806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCT-3’）；真菌引物為：ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）；2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。

1.3.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物回收

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL；Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL；FastPfu Polymerase 0.4 μL；BSA 0.2 μL；Template DNA 10 ng；補(bǔ)ddH2O至20 μL。

PCR參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，10 ℃保持至停止。隨后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，再次用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

高通量測序完成后[8-9]，根據(jù)PE序列之間的overlap關(guān)系，將成對的序列拼接成一條序列[10]，同時(shí)對序列的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。去除有效序列中的非特異性擴(kuò)增片段、模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)、長度過短的序列（序列長度小于200 bp）以及PCR過程中產(chǎn)生的一些嵌合體，得到精準(zhǔn)分析的優(yōu)化序列。根據(jù)序列的相似性，將序列相似性大于等于97%分歸為同一操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[11]，將所有序列與Silva庫比對，得到序列的分類學(xué)信息。構(gòu)建稀釋曲線[12]和Shannon曲線[13]，判斷取樣的合理性和測序量、測序深度的有效性。

群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析（Alpha多樣性）[14]可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Chao指數(shù)和ACE指數(shù)用于反映樣品中所含OTU數(shù)目和估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)常用來估算樣品中微生物的多樣性，覆蓋率是反映測序深度指數(shù)之一，其數(shù)值越高說明樣本中序列被測出的概率越高。本實(shí)驗(yàn)在OTU相似水平97%條件下評估多樣性指數(shù)。

1.4.2 測序數(shù)據(jù)繪圖

測序數(shù)據(jù)采用R語言工具編輯繪圖；主成分分析采用SPSS 20.0軟件分析制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.1.1 序列統(tǒng)計(jì)

通過對樣品DNA進(jìn)行測序，總共得到117 869 條細(xì)菌的有效序列，平均長度在450 bp左右，由圖1a可知，測序長度主要分布在421～460 bp（97.92%）之間，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長度接近，由此判斷測序結(jié)果較好。此外，共得到136 040 條真菌的有效序列，平均長度為270～290 bp，由圖1b可知，測序長度集中分布在280～320 bp，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列長度為300 bp左右較接近，說明本次測序結(jié)果較合理。

圖1 測序序列的長度分布Fig. 1 Length distribution of sequencing

2.1.2 測序有效性分析

稀釋曲線可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，當(dāng)曲線趨向平緩時(shí)，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。Shannon指數(shù)是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。根據(jù)圖2和圖3的結(jié)果可得，各曲樣的稀釋性曲線和Shannon曲線都隨測序深度的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，這表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度能夠反映出樣品中絕大多數(shù)微生物的物種信息。

圖3 大曲樣品Shannon曲線Fig. 3 Shannon curves of bacteria and fungi in Daqu samples

2.1.3 Alpha多樣性分析

表1 大曲樣品細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of bacteria in Daqu samples

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為便于進(jìn)行分析，通過歸類操作，將序列相似性大于等于97%分歸為同一OTU。由表1可知，遂寧1和遂寧2曲樣OTU數(shù)最高，分別為163 個(gè)和162 個(gè)，其次是宜賓曲樣（96 個(gè)），最低的是瀘州取樣（79 個(gè)）；4 個(gè)曲樣的優(yōu)質(zhì)序列分別為18 157、29 172、33 850 條和25 974 條，占有效序列的比例較高；Chao指數(shù)和ACE指數(shù)是用于計(jì)算群落豐度的指數(shù)，其值越大說明樣品中微生物的豐度越高，根據(jù)表1結(jié)果，遂寧2曲樣的豐度最高，瀘州曲樣的豐度最低；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)，根據(jù)表1的結(jié)果可知遂寧1曲樣的群落多樣性最高，瀘州曲樣的群落多樣性最低；4 個(gè)樣品的覆蓋率值均大于0.999，說明樣本中的序列基本完全被測出，測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

表2 大曲樣品真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of fungi in Daqu samples

由表2可知，4 個(gè)樣品的優(yōu)化序列數(shù)均在30 000 條以上；在相似度97%條件下遂寧1曲樣獲得最多的67 個(gè)OTU，其后是遂寧2、宜賓、瀘州曲樣OTU數(shù)分別為63、42 個(gè)和32 個(gè)；Chao指數(shù)和ACE指數(shù)顯示遂寧2曲樣的群落豐度要高于其他3 個(gè)曲樣；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表明在群落結(jié)構(gòu)的多樣性上，4 個(gè)曲樣的高低依次是遂寧2＞遂寧1＞瀘州＞宜賓；4 個(gè)樣品的覆蓋率均大于0.999，說明各樣本文庫的覆蓋率較高，樣本中的序列基本完全被測出，測序結(jié)果真實(shí)可靠。

2.1.4 OTU分布Venn分析

對不同大曲樣品獲取的OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，對不同樣品之間相對共有的以及獨(dú)有的OTU數(shù)進(jìn)行疊加，得出OTU分布Venn圖[15]，以比較OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。

根據(jù)OTU的分類結(jié)果，4 個(gè)大曲樣品的細(xì)菌OTU總數(shù)為181 個(gè)。由圖4a可知，在4 個(gè)大曲樣品的細(xì)菌共有OTU數(shù)為42 個(gè)，占OTU總數(shù)的23%，宜賓、遂寧1、遂寧2、瀘州曲樣獨(dú)有的OTU分別為7、57、45、3 個(gè)。宜賓和遂寧1曲樣的共有OTU數(shù)為58 個(gè)，遂寧1和遂寧2曲樣共有的OTU數(shù)為104 個(gè)占總OTU的57%以上，遂寧2和瀘州樣品的共有OTU數(shù)為58 個(gè)，宜賓和遂寧2曲樣的共有OTU數(shù)為55 個(gè)，宜賓和瀘州曲樣的共有OTU數(shù)為71 個(gè)，占總OTU數(shù)的40%左右?？芍鞂?和遂寧2曲樣的細(xì)菌OTU歸類相似度最高，宜賓和瀘州曲的OTU較相似。由此可以得出，大曲生產(chǎn)基地地理位置越相近，其樣品中共有的OTU數(shù)越多，這是否存在巧合，需要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

圖4 不同大曲細(xì)菌（a）和真菌（b）OTU的差異性Fig. 4 OTU variability of bacteria (a) and fungi (b) from different Daqu samples

4 個(gè)大曲樣品真菌的OTU總數(shù)為89 個(gè)，共同OTU為12 個(gè)占OTU總數(shù)的13%，宜賓、遂寧1、遂寧2、瀘州大曲樣品的獨(dú)有OTU數(shù)為7、25、21、6 個(gè)。宜賓和遂寧1曲樣的共有OTU數(shù)為22 個(gè)，遂寧1、遂寧2曲樣共有的OTU數(shù)為36 個(gè)，占總OTU的40%以上，遂寧2、瀘州樣品的共有OTU數(shù)為12 個(gè)，宜賓、遂寧2曲樣的共有OTU數(shù)為21 個(gè)，宜賓、瀘州曲樣的共有OTU數(shù)為21 個(gè)，因此遂寧1、遂寧2曲樣的真菌OTU歸類較相似。

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 大曲樣品中細(xì)菌門的分類

將各類OTU的代表序列與silva細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到每個(gè)OTU在不同分類水平的物種分類信息，分析樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。如圖5所示，4 種曲樣共分類得到10 個(gè)門類分別為放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chlamydiae）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門占比較大，分別為74.51%、16.45%、7.52%和0.99%，與陳玲等[16]對濃香型大曲中微生物多樣性的研究結(jié)果較一致。其中厚壁菌門均為濃香型大曲中絕對的優(yōu)勢微生物，這是由于厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[17]，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，能夠在相對極端的條件保持生長代謝；放線菌廣泛分布于土壤環(huán)境、海洋環(huán)境、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中[18]，同時(shí)和厚壁菌門相似，也具有極強(qiáng)的耐受性。

圖5 大曲樣品中細(xì)菌門類分布情況Fig. 5 Distribution patterns of bacteria at the phyla level in Daqu samples

2.2.2 大曲樣品中細(xì)菌屬的分類

在屬的水平上總共得到82 個(gè)屬，將豐度低于1%的合并為一類（others），由圖6所示，4 種曲樣中豐度較高的為厚壁菌門下的葡萄球菌屬（Staphylococcus，18.21%）、魏斯氏菌屬（Weissella，12.67%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，10.29%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，7.97%）、Kroppenstedtia（7.18%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，7.98%）、片球菌屬（Pediococcus，3.07%）、Lentibacillus（1.43%）、乳球菌屬（Lactococcus，1.40%），放線菌門下的糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，9.33%）、短桿菌屬（Brevibacterium，2.75%）。4 種曲樣的優(yōu)勢菌屬主要分布在葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬、高溫放線菌屬、乳桿菌屬和Kroppenstedtia屬中，這與王彩虹[19]得到的濃香型大曲優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬（Leuconostoc spp.）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、片球菌屬、高溫放線菌屬、糖多孢菌屬的結(jié)果較為相似，但本研究結(jié)果與之不同之處在于，在遂寧1、遂寧2曲樣中存在高豐度的葡萄球菌屬，葡萄球菌屬廣泛分布于土壤、空氣、水、灰塵中[20]，可能是由地域環(huán)境和大曲制作方法的不同造成的。

圖6 大曲樣品中細(xì)菌屬類分布情況Fig. 6 Distribution patterns of bacteria at the genus level in Daqu samples

宜賓曲樣的優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬（25.23%）、芽孢桿菌屬（19.96%）、高溫放線菌屬（16.26%）和糖多孢菌屬（14.79% ）；遂寧1曲樣中葡萄球菌屬（26.38%）、Kroppenstedtia屬（12.77%）和芽孢桿菌屬（9.73%）所占比例較高；遂寧2曲樣占主導(dǎo)地位的菌屬為葡萄球菌屬（31.62%）、糖多孢菌屬（15.87%）、Kroppenstedtia屬（11.64%）和芽孢桿菌屬（9.48%）；此外，乳桿菌屬（28.96%）、魏斯氏菌屬（27.66%）、高溫放線菌屬（13.12%）、片球菌屬（7.39%）在瀘州曲樣中為優(yōu)勢菌屬。

魏斯氏菌屬屬于乳酸細(xì)菌，有一定的耐酸性，在發(fā)酵產(chǎn)品中分布廣泛其分解葡萄糖產(chǎn)生CO2異型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸[21]，有利于乳酸乙酯的形成及酒質(zhì)的穩(wěn)定，是白酒釀造中的重要微生物之一。王海燕等[22]、李德林[23]均利用PCR-變性梯度凝膠電泳16S rRNA基因文庫在濃香型白酒酒醅中鑒定出魏斯氏菌屬且豐度較高，而在窖泥中未發(fā)現(xiàn)有該菌屬的報(bào)道，因此可以推斷大曲是白酒釀造中魏斯氏菌屬的主要來源。芽孢桿菌屬能產(chǎn)芽孢因此具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，普遍存在于白酒生產(chǎn)的各個(gè)微生態(tài)環(huán)境中，是產(chǎn)乳酸、產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的重要菌屬[24]，同時(shí)也是大曲中風(fēng)味物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌之一。糖多孢菌屬在分類學(xué)上屬于放線菌門下一類形態(tài)相似的微生物[25]，能產(chǎn)生酶類、維生素、纖維素降解促進(jìn)因子等，是一類安全的生物資源菌，在濃香型大曲中普遍存在。高溫放線菌屬具有耐高溫、生長快的特點(diǎn)，可產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶[26]對白酒的風(fēng)味和原料的利用有重要作用，近幾年研究發(fā)現(xiàn)其不僅僅存在于高溫大曲中，研究表明[19,27-28]在中高溫的濃香型大曲中高溫放線菌屬也有較高的分布，其豐度受制曲溫度的影響，和本研究的結(jié)果類似。

2.3 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 大曲樣品中真菌門的分類

將得到的各類OTU的代表序列與Unite的真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到每個(gè)OTU在不同分類水平的物種分類信息，分析其群落結(jié)構(gòu)。由圖7所示，4 個(gè)曲樣的真菌組成可準(zhǔn)確歸為3 個(gè)門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota），其中子囊菌門真菌占比最大，達(dá)97.97%，擔(dān)子菌門和接合菌門分別為1.63%和0.40%，這與張會敏等[3]利用ITS rDNA克隆文庫法得到的中溫大曲中真核微生物的門類為子囊菌門、毛霉亞門（Mucoromycotina）、擔(dān)子菌門的研究結(jié)果相似。4 個(gè)曲樣的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門，豐度均在95%以上。此外，在遂寧1和遂寧2曲樣中擔(dān)子菌門的占比分別為4.08%和2.49%，而在宜賓和瀘州曲樣中含量較少；瀘州曲樣中有1.32%的接合菌門，這在其他3 個(gè)曲樣中含量較少。盡管這些存在差異的微生物群落豐度較小，但同樣不能忽視它們在釀造中起到的特征性作用。

圖7 大曲樣品中真菌門類分布情況Fig. 7 Distribution patterns of fungi at the phyla level in Daqu samples

2.3.2 大曲樣品中真菌屬的分類

圖8 大曲樣品中真菌屬分布情況Fig. 8 Distribution patterns of fungi at the genus level in Daqu samples

在屬的水平上4 個(gè)曲樣的OTU可歸為37 個(gè)屬，由圖8可知，4 個(gè)大曲樣品的真菌群落均不如細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富。這是由于濃香型大曲在制曲過程中最高品溫一般在50 ℃以上[29]，而大多數(shù)真菌生長最適溫度為20～30 ℃，致死溫度為50～60 ℃[30]，因此只有少部分耐熱和嗜熱真菌得以存活。4 個(gè)大曲樣品中總體豐度較高的有嗜熱真菌屬（Thermomyces，38.55%）、曲霉屬（Aspergillus，31.27%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，17.60%）、絲衣霉屬（Byssochlamys，2.52%）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia，1.56%）和屬級分類地位未知的散囊菌目菌屬（Eurotiales_unclassified，4.73%）。酵母在4 個(gè)曲樣中豐度均不高，僅在宜賓曲樣中鑒定出2.74%酵母目下的Saccharomycetales_unidentified，其余如威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、絲孢酵母菌（Trichosporon）等雖有鑒定出但其豐度均小于1%。羅惠波等[31]運(yùn)用分離培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定的方法對濃香型大曲中的真菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，表明釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等在總共29 個(gè)OTU中占比在1%～3%之間，本研究由于利用高通量測序能得到的OTU數(shù)更多，因此可推斷酵母的OTU數(shù)所占比例會更小。

盡管大曲中的真菌群落多樣性較細(xì)菌更為單薄，但其對出酒率，發(fā)酵生香等仍具有不可替代的作用。宜賓曲樣中優(yōu)勢菌屬為嗜熱真菌屬（66.25%）和嗜熱子囊菌屬（29.23%），該類真菌具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶類的能力[32]，且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，能夠在白酒發(fā)酵過程中溫度較高的條件下保持穩(wěn)定的催化效率；其次為Saccharomycetales_unidentified（2.74%）；瀘州曲樣各屬的豐度高低依次為嗜熱真菌屬（61.91%）、嗜熱子囊菌屬（33.90%）、翹孢霉屬（Emericella，1.18%）、曲霉屬（1.16%）、根霉屬（Rhizopus，1.12%）。遂寧1和遂寧2曲樣的優(yōu)勢菌屬均為曲霉屬比例分別占到76.09%和52.49%，曲霉屬是自然界分布極廣的一類霉菌，是釀酒和食品加工業(yè)的重要菌種有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶及代謝有機(jī)酸的能力，對白酒的產(chǎn)酒、生香有重要作用；此外，Eurotiales_unclassified、嗜熱真菌屬、節(jié)擔(dān)菌屬、絲衣霉屬和嗜熱子囊菌屬均占有不同比例；通過分析發(fā)現(xiàn)，4 種大曲中均存在不同水平的Ascomycota_unclassified、曲霉屬、隱球菌屬（Cryptococcus）、Nectriaceae_unclassified、Pleosporales_unclassified、根霉屬、Saccharomycetales_unidentified、嗜熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬。彎孢屬（Curvularia）和異莖點(diǎn)霉屬（Paraphoma）只在宜賓曲樣中存在。只從遂寧1和遂寧2大曲樣品中鑒定出的真菌菌屬有Auxarthron、Blastobotrys、Eurotiomycetes_unclassified、Fungi_unclassified、Microascaceae_unclassified、小囊菌屬（Microascus）、紅曲霉屬（Monascus）、Saccharomycetales_unclassified、Sordariales_unidentified和籃狀菌屬（Talaromyces）。而背芽突霉屬（Cadophora）、Sordariomycetes_unclassified和Xylariales_unclassified只存在于瀘州取樣中。由此可見，不同的制曲工藝、地域環(huán)境等因素均是造成不同大曲間微生物多樣性差異的原因。

通過對不同樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，遂寧的兩個(gè)曲樣真菌的多樣性均高于宜賓和瀘州的曲樣，其間最大的不同在于遂寧的兩個(gè)曲樣中的曲霉菌屬和Eurotiales_unclassified菌屬遠(yuǎn)高于宜賓和瀘州的曲樣，而嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬的比例又遠(yuǎn)低于宜賓和瀘州的曲樣，結(jié)合各自的大曲制作工藝可得，宜賓和瀘州的大曲發(fā)酵的最高品溫均高于遂寧的曲樣，由此可推斷，大曲發(fā)酵中溫度的控制和選擇對大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王彩虹[33]、董瑞麗[34]等的研究結(jié)果具有較好的一致性。

2.4 不同樣品微生物群落主成分分析

圖9 大曲樣品的細(xì)菌（a）和真菌（b）主成分分布圖Fig. 9 Principal component distribution of bacteria (a) and fungi (b) in Daqu samples

利用SPSS 20軟件對各樣品微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析。如圖9所示，在細(xì)菌群落中，共得到3 個(gè)主成分因子，PC1、PC2和PC3貢獻(xiàn)率分別為83.6%、13.23%和3.17%，PC1上貢獻(xiàn)率較大的OTU所代表的微生物為葡萄球菌屬、糖多孢菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬；PC2上貢獻(xiàn)率較大的OTU所對應(yīng)的微生物為葡萄球菌屬、糖多孢菌屬、乳桿菌屬、高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬，PC1和PC2成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)96.83%，可較全面解釋樣品的差異。

在真菌群落中，共得到3 個(gè)主成分因子，PC1、PC2和PC3貢獻(xiàn)率分別為96.13%、3.47%和0.4%。PC1上貢獻(xiàn)率較大的微生物屬為曲霉屬、嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬和Eurotiales_unclassified；在PC2上絲衣霉屬、曲霉屬、嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬和Eurotiales_unclassified有較大的貢獻(xiàn)率，兩種主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.60%，可完全反映出樣品真菌結(jié)構(gòu)的差異。

如圖9所示，在細(xì)菌群落上，遂寧1、遂寧2曲樣距離相近，即該樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較宜賓和瀘州曲樣更相似，而宜賓曲樣和瀘州曲樣在PC1成分方向上距離相近，而在PC2方向上距離較大，說明樣品中高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬等微生物的豐度差異是造成兩個(gè)樣品差異的主要因素。同理，宜賓和瀘州曲樣中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異較??；而遂寧1、遂寧2曲樣在PC2方向上距離較遠(yuǎn)，其差異主要體現(xiàn)在絲衣霉屬等的相對豐度上。綜合來看，宜賓、瀘州曲樣的微生物群落結(jié)構(gòu)較相似，遂寧1和遂寧2群落結(jié)構(gòu)比較相似。這可能是由于地區(qū)位置越相近，其環(huán)境微生物更加相似，因此，釀造環(huán)境對大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不可忽視。

3 結(jié) 論

通過高通量測序分析比較四川不同地區(qū)濃香型大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)遂寧曲樣細(xì)菌和真菌的多樣性均比宜賓和瀘州曲樣豐富。在屬水平上，遂寧1和遂寧2曲樣中葡萄球菌屬、Kroppenstedtia、曲霉屬、Eurotiales_unclassified占比較高，且比例遠(yuǎn)高于宜賓和瀘州曲樣。而宜賓和瀘州大曲中魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬、嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬的比例均高于遂寧的兩個(gè)曲樣。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，遂寧的兩個(gè)大取樣品中微生物群落具有較高的相似性，而宜賓和瀘州大曲樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)更相似。由此可見，不同地區(qū)的大曲微生物群落結(jié)構(gòu)各具特點(diǎn)，其間的差異性可能是由區(qū)域環(huán)境微生物的不同而造成，同時(shí)又受到大曲生產(chǎn)工藝的調(diào)節(jié)。本研究對了解不同地區(qū)大曲中的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異提供了大量數(shù)據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步了解不同地區(qū)濃香型白酒之間的差異提供理論基礎(chǔ)，將促進(jìn)白酒行業(yè)的特色化發(fā)展。