油腐乳發(fā)酵過程中的品質分析

魏冠棉，張軍偉，周 鵬*

（江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫 214122）

腐乳在我國具有悠久的歷史，它是采用天然大豆經加工發(fā)酵而成，具有風味獨特、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點[1]。根據是否有微生物參與，腐乳可以分為腌制型腐乳和發(fā)酵型腐乳[2-3]：由于腌制型腐乳發(fā)酵周期長、產品質地粗糙、氨基酸含量低等弊端，所占比重很?。话l(fā)酵型腐乳根據菌種的不同可以分為毛霉型腐乳、根霉型腐乳和細菌型腐乳[4-5]，由于毛霉具有豐富且有益的酶系，賦予了毛霉型腐乳柔糯細膩的口感，因此國內90%～95%腐乳菌種為毛霉[6-8]。目前腐乳常用的毛霉菌種有總狀毛霉、雅致放射毛霉和五通橋毛霉[6,9]。3 種毛霉分布在不同的腐乳產地，目前尚鮮見對比其對腐乳的品質、微觀結構和流變性質影響的研究報道。

油腐乳是云貴地區(qū)特色發(fā)酵食品。該地區(qū)特殊的地理氣候條件形成了利于油腐乳發(fā)酵的獨特微生物菌群，使得所生產的油腐乳品質優(yōu)異而香氣濃郁。與其他地區(qū)腐乳不同的是，它采用乳酸菌作為豆腐的凝固劑；在腐乳的湯料中，用菜籽油代替水，賦予了油腐乳獨特的風味和豐富的脂類營養(yǎng)物。

本研究主要結合云貴地方特色油腐乳，采用不同毛霉菌種發(fā)酵油腐乳，并分析發(fā)酵過程中油腐乳的品質、結構和流變性質的動態(tài)變化，研究不同毛霉菌種對油腐乳的影響，以期為油腐乳的研究和生產提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油腐乳生產過程中的原輔料取自云南牟定腐乳生產企業(yè)；篩選菌種為來自實驗室前期篩選保存優(yōu)質毛霉菌株（Mucor racemosus MD-102），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 15264；生產用雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）CICC 40701、總狀毛霉（M. racemosus）CICC 40491、五通橋毛霉（M. wutungkiao）CICC 40854來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

氫氧化鈉、硫氰酸鉀標、硝酸銀甲醛、硫酸鐵銨、硼酸、溴甲酚綠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸、無水硫酸銅、硫酸鉀、酪蛋白、鹽酸、三氯乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

T10 basic分散機、IKA-RO10攪拌器 德國IKA儀器設備有限公司；S220 Seven Compact pH/離子計 瑞士梅特勒-托利多公司；BGZ-246電恒溫烘箱 上海博迅實業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋HWS-26 上海雙旭電子有限公司；X08A自動消化裝置、K1302自動定氮分析儀上海晟聲自動化分析儀器有限公司；HAAKE MARSIII流變儀 美國賽默飛世爾科技公司；LSM710激光共聚焦顯微鏡 德國卡爾·蔡司公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 油腐乳的制備與采集

油腐乳制備：取優(yōu)質大豆浸泡后磨漿，過濾后煮漿，冷卻后加入凝固劑制成豆腐，切成小塊；噴灑105CFU/mL霉菌孢子懸浮液到豆腐上，28 ℃培養(yǎng)3 d，制得毛坯；毛坯經晾曬和鹽漬，制得鹽坯；加入調料至鹽坯，裝瓶，常溫發(fā)酵3 個月，即得到油腐乳成品。

樣品采集：在前發(fā)酵0 d、前發(fā)酵4 d、晾曬、鹽漬、后發(fā)酵0 d、后發(fā)酵30 d和后發(fā)酵90 d時，隨機收集油腐乳（篩選菌種、總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉）各5 瓶。

1.3.2 油腐乳理化指標的測定

水分含量：采用直接干燥法，參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[9]；總酸含量：采用酸堿滴定法，參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[10]；氨基態(tài)氮含量：采用甲醛值法，參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》[11]；水溶性蛋白含量：參照NY/T 1205—2006《大豆水溶性蛋白含量的測定》[12]；氯化鈉含量：采用間接沉淀法，參照GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》[13]；蛋白酶活性：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[14]。

1.3.3 油腐乳微觀結構的測定

參考Peng Xingyun等[15]的方法進行掃描電子顯微鏡觀察。將油腐乳樣品切成1 mm×10 mm×10 mm的薄片，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定12 h；磷酸緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；依次采用30%、50%、70%、90%、95%和100%乙醇溶液梯度脫水，時間各為15 min；樣品經二氧化碳臨界點干燥，并通過離子濺射噴金；然后進行掃描電子顯微鏡觀察，電壓為12.5 kV，放大倍數為2 000 倍。

1.3.4 油腐乳涂抹性的測定

涂抹性測定參考Daubert[16]和Tárrega[17]等的實驗方法。腐乳樣品瀝干油并去除表面的菌絲膜，用研缽研磨均勻，取約1 g樣品至流變儀進行分析。采用P35 TiL平板，間隙為1 mm，剪切速率1～100 s-1，時間為300 s，每個樣品在25 ℃重復3 次。

1.3.5 感官評價

油腐乳的感官評價通過形、色、香、滋、質地5 個方面制定感官評分標準[18-19]，選定15 名感官評價人員，按照表1進行評分。

表1 油腐乳感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of oil sufu

2 結果與分析

2.1 毛霉生長狀況

如圖1所示，經4 d培養(yǎng)后，篩選菌種和總狀毛霉的菌絲短小、致密且潔白；雅致放射狀毛霉和五通橋毛霉的菌絲相對較稀疏，但二者的菌絲較長，利于油腐乳毛坯外層菌膜的形成，即利于維持腐乳的塊形。

圖1 4 種毛霉菌種在PDA培養(yǎng)基及油腐乳白坯上培養(yǎng)4 d的外觀Fig. 1 Appearance of four Mucor strains cultured on PDA medium and tofu for 4 days

2.2 油腐乳發(fā)酵過程中蛋白酶活性的分析

由圖2可知，蛋白酶活性隨發(fā)酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢，這與文獻[20-21]的研究結果相一致。在前發(fā)酵過程中，霉菌不斷生長繁殖并分泌和累積蛋白酶，故使得油腐乳白坯中蛋白酶活性的升高。在前發(fā)酵4 d后，雅致放射毛霉和五通橋毛霉的蛋白酶活性大于20 U/g，明顯高于總狀毛霉和篩選菌株（15 U/g和7.5 U/g）。經晾曬后樣品中蛋白酶活性降低，可能是因為蛋白酶隨著水分而流失，且水分的缺失使得霉菌分泌蛋白酶受限；與其他3 組樣品不同的是篩選菌種的酶活性進一步升高，表明篩選菌在水分降低時仍可以生長和分泌蛋白酶。在鹽漬和后發(fā)酵過程中，由于鹽對蛋白酶的抑制作用，使得油腐乳中的蛋白酶活性進一步降低。由于篩選菌種與總狀毛霉均親緣關系較近，故二者蛋白酶的變化幅度相一致；而五通橋毛霉發(fā)酵油腐乳的蛋白酶活性在后發(fā)酵過程中呈上升趨勢，表明五通橋毛霉在后發(fā)酵過程中耐高鹽性優(yōu)于前三者。

圖2 油腐乳發(fā)酵過程中蛋白酶活性的變化Fig. 2 Change in protease activity of oil sufu during fermentation

2.3 油腐乳發(fā)酵過程中理化性質的分析

通過測定不同發(fā)酵時期腐乳的總酸、氨基態(tài)氮和水溶性蛋白等理化指標表征腐乳發(fā)酵過程的成熟度，并用以檢測腐乳品質的動態(tài)變化[22-23]，結果見圖3。

圖3 油腐乳發(fā)酵過程中理化性質的變化Fig. 3 Changes in physicochemical properties of oil sufu during fermentation

水溶性蛋白質是腐乳中重要的風味前體物質，與腐乳品質有密切關系[23-25]。從圖3可知，隨著后發(fā)酵時間的延長，水溶性蛋白含量逐漸增加，且符合行業(yè)標準對成品腐乳的氨基態(tài)氮含量的要求。后發(fā)酵過程中，篩選菌種的水溶性蛋白含量最高，其余依次為總狀毛霉、雅致放射毛霉和五通橋毛霉，表明了篩選菌種在油腐乳水解蛋白能力最強，這與后發(fā)酵過程中蛋白酶活性變化相一致。

氨基態(tài)氮是判斷腐乳發(fā)酵程度的特性指標之一；氨基態(tài)氮含量越高，則氨基酸含量越高，腐乳的鮮味越好[23-24]。從圖3可知，隨著后發(fā)酵時間的延長，氨基態(tài)氮含量逐漸增加，且符合腐乳成熟標準要求。篩選菌種組氨基態(tài)氮含量增長最快，總狀毛霉和雅致放射毛霉次之，五通橋毛霉組最小。該研究結果表明篩選菌種在油腐乳后發(fā)酵過程中的蛋白分解代謝優(yōu)勢優(yōu)于其他3 種毛霉，總狀毛霉和雅致放射毛霉分解代謝蛋白能力相近，五通橋毛霉代謝生成氨基態(tài)氮的能力低于其他3 種毛霉。

總酸是衡量腐乳質量的重要指標之一，同時也可以反映腐乳的發(fā)酵程度[25]。在腐乳發(fā)酵過程中，蛋白質、脂肪和碳水化合物在酶的作用下生成游離氨基酸、游離脂肪酸和有機酸，它們形成了油腐乳的酸度。從圖3可知，油腐乳在后發(fā)酵過程中，總酸含量隨時間延長而上升，且符合標準對成品腐乳的總酸含量的要求。在后發(fā)酵90 d時，4 組油腐乳總酸質量分數為篩選菌種（2.18%）＞總狀毛霉（2.08%）＞雅致放射毛霉（2.05%）＞五通橋毛霉（1.98%），表明篩選菌種在油腐乳分解代謝生成游離氨基酸、游離脂肪酸和有機酸的優(yōu)勢大于其他3 種毛霉。

水分含量反映網絡結構的空間大小和完整性[26-27]，這將影響油腐乳的微觀結構和質構特性。由圖3可知，不同毛霉發(fā)酵油腐乳在后發(fā)酵過程中水分質量分數基本相同，穩(wěn)定在60%左右，表明發(fā)酵菌種與油腐乳后發(fā)酵水分含量相關性小。

鹽在油腐乳發(fā)酵過程中的作用主要是賦予油腐乳咸味，降低水分含量，抑制后發(fā)酵過程中酶活性，防止過度發(fā)酵而引起質量問題，抑制毛霉等有益微生物過度生長，尤其是抑制和防止雜菌和致病菌的生長[4,28]。由圖3可知，隨著油腐乳后發(fā)酵時間延長，鹽質量分數在10%左右并符合標準的要求。

2.4 油腐乳發(fā)酵過程中微觀結構的分析

食品的微觀結構與理化性質之間具有顯著相關性，蛋白質水解會改變蛋白聚集狀態(tài)和凝膠結構[29-31]，因此會引起腐乳微觀結構的變化。此外，食品的微觀結構與食品的功能性和消費者的接受度息息相關[32]。

圖4 油腐乳發(fā)酵過程中微觀結構的變化Fig. 4 Scanning electron microscopic images of oil sufu during fermentation

由圖4可知，在前發(fā)酵0 d，4 種油腐乳內部均為孔洞大小不一的蛋白凝膠網絡結構。這主要是因為霉菌被接種到豆腐白坯上，其未分泌蛋白酶以破壞蛋白的網絡結構。前發(fā)酵4 d，蛋白凝膠的網絡結構孔隙在一定程度上縮小，蛋白聚集體減小。這主要是由于前發(fā)酵過程中毛霉在豆腐白坯上生長繁殖并分泌蛋白酶，部分大豆蛋白經水解作用后被分解。由圖4可知，雅致放射毛霉和五通橋毛霉組的微觀結構變化比篩選菌種和總狀毛霉組的明顯，這主要是前兩者的蛋白酶活性和蛋白水解程度大于后兩者（圖2）引起。油腐乳毛坯在晾曬與鹽漬過程中經環(huán)境條件和鹽的滲透作用析出大量水分，使得坯體收縮且蛋白凝膠的網絡結構孔隙進一步縮??；因蛋白酶活性受到不同程度的抑制使得蛋白水解程度不同，從而使得毛坯的微觀結構變化程度不同。在后發(fā)酵過程中，蛋白的聚集體被進一步降解，蛋白凝膠的網絡結構更致密。由于鹽對蛋白酶、微生物生長和分泌酶的抑制作用，后發(fā)酵過程中蛋白水解速率降低，油腐乳微觀結構的變化變緩。篩選菌種、總狀毛霉和雅致放射毛霉的酶活性相一致，故三者的微觀結構類似；后發(fā)酵前期五通橋毛霉的酶活性小于前三者，故其微觀結構在后發(fā)酵0～30 d時變化緩慢且仍可觀察到小的蛋白聚集體，隨著蛋白酶活性的增加凝膠結構變得致密；此變化與水溶性蛋白和氨基態(tài)氮含量的變化相一致。

2.5 油腐乳發(fā)酵過程中涂抹性的變化

圖5 油腐乳發(fā)酵過程中涂抹性的變化Fig. 5 Changes in spreadability of oil sufu during fermentation

涂抹性是油腐乳結構的最重要組成部分之一，它很大程度上影響消費者的接受度；涂抹性可以通過屈服應力來表示，樣品的屈服應力越小代表其涂抹性越好[33-34]。屈服應力是指樣品發(fā)生最初流動時所需的最小剪應力[35-36]，這是液體和固體材料的物理和流變特性[37]。如圖5所示，隨著油腐乳后發(fā)酵時間的延長，屈服應力逐漸降低，涂抹性逐漸提高；表明隨著蛋白水解程度的增大，在一定剪切速率下所需的破壞蛋白質凝膠網絡結構的剪切力減小，產品變得更加柔軟且涂抹性增強。在后發(fā)酵過程中4 組油腐乳屈服應力為篩選菌種（1 060.33 Pa）＞總狀毛霉（866.60 Pa）＞五通橋毛霉（855.90 Pa）＞雅致放射毛霉（740.57 Pa），表明雅致放射毛霉組油腐乳涂抹性最好，其余依次為五通橋毛霉、總狀毛霉和篩選菌種。

2.6 油腐乳的感官評價

圖6 油腐乳的感官評價Fig. 6 Sensory evaluation of oil sufu

由圖6可知，油腐乳樣品的塊形無較大差異，這主要是由于篩選菌種和總狀毛霉的菌絲致密，可以形成良好的菌絲膜包被腐乳塊；而雅致放射毛霉和五通橋毛霉菌絲雖稀疏但菌絲長，亦可以形成菌絲膜以確保油腐乳的完整塊形。雅致放射毛霉和總狀毛霉發(fā)酵油腐乳樣品的香氣略優(yōu)于篩選菌種和五通橋毛霉發(fā)酵的油腐乳，這是由于前兩者的酶系較為豐富。雅致放射毛霉和五通橋毛霉發(fā)酵油腐乳樣品的色澤略優(yōu)于另外兩組，主要是由于篩選菌種和總狀毛霉發(fā)酵的油腐乳在空氣中放置一段時間后，表皮略微變暗，這可能是油腐乳中的還原性物質發(fā)生氧化反應所引起的?？偁蠲?、雅致放射毛霉和篩選菌株組的滋味評分高于五通橋毛霉組，這主要因為品嘗后者樣品時舌尖有輕微的灼痛感，這可能是五通橋毛霉在代謝過程中產生了某種物質所引起的?？偁蠲?、雅致放射毛霉和五通橋毛霉的質地優(yōu)于篩選菌株組毛霉，與涂抹性的結果相一致，這主要因為樣品的質地主要取決于樣品的成分含量以及蛋白、脂肪和水分之間的相互作用，表明篩選菌株的綜合代謝作用略低于其他三者，為混合發(fā)酵以提高油腐乳質地提供依據。

3 結 論

通過研究云貴地區(qū)特色發(fā)酵油腐乳在發(fā)酵過程中霉菌的表觀性狀、蛋白酶活性、成熟度、微觀結構、涂抹性和感官性質，發(fā)現不同毛霉發(fā)酵的油腐乳成熟度、結構、流變和感官性質各有優(yōu)勢。綜合考慮菌種發(fā)酵油腐乳的優(yōu)點，后期可以圍繞毛霉混合發(fā)酵油腐乳及其對生產周期的影響開展深入的研究，以期得到優(yōu)化的油腐乳，為油腐乳實際生產的品質和工藝提供一定的理論依據。