氧化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)、乳液穩(wěn)定性及消化特性的影響

沈鵬輝，樊詩(shī)堃，趙謀明，周非白*

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，其必需氨基酸組成完整，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近于動(dòng)物蛋白。同時(shí)，因具有多種功能特性，大豆蛋白被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。然而在豆制品加工過(guò)程中，高活性脂肪氧合酶易催化多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧及次生氧化產(chǎn)物，可進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白氧化[1]。氧化通過(guò)修飾氨基酸側(cè)鏈可以改變蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)；而羰基、共價(jià)鍵的形成等會(huì)進(jìn)一步改變蛋白構(gòu)象，導(dǎo)致其二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[2]。蛋白的結(jié)構(gòu)與功能緊密相關(guān)，而氧化通常會(huì)伴隨著蛋白質(zhì)溶解性、保水性、凝膠性及乳化性等[3-5]功能特性的改變，從而影響蛋白的加工特性。生產(chǎn)實(shí)際中，油脂-蛋白共存現(xiàn)象使得蛋白氧化不可避免，鑒于脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程及產(chǎn)物的復(fù)雜性，明晰反應(yīng)主要副產(chǎn)物對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響是相關(guān)工作開(kāi)展的基礎(chǔ)。

乳液是食品工業(yè)中最重要的食品體系之一，常見(jiàn)的如牛奶、乳飲料、酸奶、涂抹醬及乳化肉制品等均可歸為蛋白穩(wěn)定的乳液體系[6]。當(dāng)今社會(huì)，高脂膳食導(dǎo)致人體能量攝入過(guò)剩，使得高血脂、肥胖等健康問(wèn)題日益突出。因此，乳液中脂質(zhì)的消化問(wèn)題受到越來(lái)越多食品科技工作者的關(guān)注[7-9]。通常認(rèn)為，乳液的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性與其消化特性具有密切關(guān)系。作為常用乳液界面穩(wěn)定劑，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是影響蛋白基乳液結(jié)構(gòu)及脂肪消化特性的直接因素。梁晗妮[10]利用不同濃度脲素作用于蕓豆7S球蛋白，發(fā)現(xiàn)高濃度的脲素會(huì)使蕓豆7S球蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)逐漸解離成單聚體，導(dǎo)致油水界面吸附蛋白濃度的減少和油滴絮凝程度的增加。Sarkar等[11]研究表明，通過(guò)控制界面蛋白的聚集可降低油脂的生物利用度，增加乳液胃排空時(shí)間，從而延緩脂質(zhì)消化。前期研究表明，氧化可改變蛋白分子間的交聯(lián)類型及交聯(lián)程度，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及表面特性的變化，進(jìn)而影響蛋白的界面行為及體相/界面蛋白的相互作用[12]。目前，關(guān)于氧化誘導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)乳液消化特性影響的研究仍然很有限。

本實(shí)驗(yàn)以丙二醛（malondialdehyde，MDA）為代表性次級(jí)油脂氧化產(chǎn)物作用于大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI），研究不同MDA濃度作用下蛋白結(jié)構(gòu)（巰基、羰基、席夫堿、等電點(diǎn)和亞基組成）的變化。進(jìn)一步以氧化蛋白制備水包油（O/W）型乳液并建立體外模擬脂質(zhì)消化體系，研究乳液在消化過(guò)程中的穩(wěn)定性及脂肪酸釋放動(dòng)力學(xué)。本研究擬從生物化學(xué)角度探究氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)、乳液形成及乳液消化特性的影響及內(nèi)在關(guān)聯(lián)，為全面評(píng)估蛋白質(zhì)氧化行為對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康的影響提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍脫脂豆粕 山東禹王有限公司；金龍魚(yú)玉米油市售；1,1,3,3-四甲氧基丙烷、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、乙二胺四乙酸二鈉 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化鈉、甲醇、乙酸 廣州精科化玻儀器公司；溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R250、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、巰基乙醇、甘油、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺 美國(guó)Genview公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SL2000A多功能粉碎機(jī) 青島納麗雅廚具設(shè)備有限公司；EL 204/EL 3002電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Sorvall Legend Micro 17微量離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；WN7501V紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佐科工業(yè)設(shè)備有限公司；pHS-3E pH計(jì) 北京雷磁儀器有限公司；Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；JB-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司；Nano-ZS納米粒度及Zeta電位分析儀、Mastersizer 2000粒度分布儀 英國(guó)Malvern公司；THZ-82A恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司；C300化學(xué)發(fā)光分子成像系統(tǒng)美國(guó)Azure Biosysterms公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

將脫脂低溫豆粕粉碎至粉末，過(guò)40 目篩，然后以1∶10的質(zhì)量比加入蒸餾水分散，并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0，在室溫下攪拌2 h。然后紗布過(guò)濾，室溫下以8 000×g離心20 min，收集上清液，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5，4 ℃靜置30 min后離心（8 000×g，20 min），收集沉淀，后用蒸餾水洗滌沉淀多次除去表面殘留清蛋白。取出沉淀稱量濕質(zhì)量，加入濕質(zhì)量7 倍的蒸餾水后緩慢攪拌，調(diào)節(jié)至pH 7.5，待樣品溶解后透析48 h，期間每6 h換水一次。透析后凍干，所得分離蛋白于干燥低溫的環(huán)境下保存?zhèn)溆?，并以凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量。

1.3.2 MDA儲(chǔ)備液及氧化SPI的制備

1.3.2.1 MDA儲(chǔ)備液的制備

通過(guò)水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷配制MDA儲(chǔ)備液，方法參照Wu Wei等[13]有所改進(jìn)。MDA儲(chǔ)備液經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，10 mmol/L，pH 7.0）稀釋后在267 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，摩爾吸光系數(shù)為31 500 L（mol·cm）。

1.3.2.2 MDA氧化SPI的制備

將SPI分散于PBS配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蛋白分散液，于室溫下攪拌2 h，4 ℃水化過(guò)夜（12 h），離心（10 000×g，20 min，20 ℃）并收集上清液。添加不同濃度的MDA溶液作用于蛋白分散液，使MDA的終濃度分別為0、0.1、1、2.5、5、10 mmol/L，體系蛋白終質(zhì)量濃度為30 mg/mL（含NaN30.5 mg/mL）?；旌衔锸覝兀?5 ℃）避光反應(yīng)24 h后透析36 h（取透析液于267 nm比色以確定透析完全）獲得不同氧化程度的蛋白，Lowry法測(cè)定蛋白濃度后凍干保存。

1.3.3 氧化SPI的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 羰基含量的測(cè)定

參考Morzel等[14]的方法，采用DNPH比色法測(cè)定氧化SPI的羰基值，結(jié)果以nmol/mg表示。

1.3.3.2 巰基含量的測(cè)定

參考Morzel等[14]的方法，通過(guò)5,5’-二硫硝基苯甲酸衍生測(cè)定氧化SPI的巰基含量，結(jié)果以nmol/mg表示。

1.3.3.3 席夫堿熒光光譜掃描

將氧化SPI用PBS稀釋至一定質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL）以進(jìn)行席夫堿的內(nèi)源熒光掃描。將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為350 nm，記錄400～600 nm的發(fā)光光譜。設(shè)定狹縫寬度為5 nm，以240 nm/min收集數(shù)據(jù)。記錄峰值及峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)。電壓為500 mV。

1.3.3.4 氧化SPI等電點(diǎn)的測(cè)定

將凍干SPI分散于蒸餾水中（1 mg/mL），充分水化后單向調(diào)整樣品pH 6.5～3.5，采用Nano-ZS納米粒度及電位分析儀測(cè)定不同pH值條件下蛋白分散液Zeta電位，并以此判斷氧化對(duì)SPI等電點(diǎn)的影響。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參照Flores等[15]的方法有所改進(jìn)，并分別在還原及非還原情況下進(jìn)行。其中還原性樣品緩沖液組成為：60 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）、2 g/100 mL十二烷基硫酸鈉，25%甘油、14.4 mmol/L β-巰基乙醇、0.05 g/100 mL溴酚藍(lán)；非還原性樣品緩沖液不含β-巰基乙醇，其他組成與還原性樣品一致。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Markers分子質(zhì)量25～170 kDa。最終上樣量為25 μg蛋白。凝膠電泳于恒流條件（25 mA）下進(jìn)行，其中濃縮膠及分離膠分別為5%及12%。凝膠染色及脫色后于C300成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片處理。

1.3.5 乳液制備

將氧化SPI分散于PBS配制成一定質(zhì)量濃度的分散液，加入玉米油，使得體系蛋白質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL，玉米油為10 g/100 mL。上述混合液經(jīng)高速均質(zhì)攪拌機(jī)預(yù)乳化（10 000×g，2 min）后，超聲處理5 min（150 W、1 s脈沖，冰浴），即得新鮮制備的乳液。添加0.02% NaN3以防微生物作用。

1.3.6 乳液體外消化模型

參考Tokle[16]和Zeeb[17]等的方法進(jìn)行乳液體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)。

模擬胃部消化：取20 mL乳液和模擬胃液（含2 g/L NaCl，84 mmol/L HCl，3.2 g/L胃蛋白酶）1∶1混合，調(diào)pH 2.0，在120 r/min、37 ℃模擬胃部消化1 h。反應(yīng)結(jié)束后調(diào)pH 7.0。

模擬腸道消化：取30 mL上述混合物與模擬腸液混合后進(jìn)行模擬腸道消化（37 ℃、120 r/min），終體系含10 mmol/L CaCl2、150 mmol/L NaCl、10 mg/mL膽鹽、1.6 mg/mL胰脂肪酶。在此消化的2 h內(nèi)，采用pH-Stat法，通過(guò)不斷加入0.1 mol/L NaOH維持體系pH 7.0，記錄反應(yīng)時(shí)間及NaOH消耗量。通過(guò)消耗的NaOH量可計(jì)算乳液體系中游離脂肪酸釋放率，公式如下：

式中：V（NaOH）為中和所產(chǎn)生的游離脂肪酸所需的氫氧化鈉的體積/mL；m（NaOH）為氫氧化鈉溶液濃度（0.1 mol/L）；WLipid為初始脂質(zhì)的總質(zhì)量（1.5 g）；MLipid為玉米油的摩爾質(zhì)量（800 g/mol）。

1.3.7 乳液的結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 乳液粒徑的測(cè)定

采用Mastersizer 2000粒度分布儀測(cè)定乳液油滴的粒徑大小。參數(shù)設(shè)置：顆粒折射率為1.473；顆粒吸收率為0.002；分散劑為水；分散劑折射率為1.330。采用d[3,2]表面積平均直徑表征油滴粒度的平均大?。?/p>

式中：ni和di分別為液滴數(shù)及液滴直徑/μm。每組測(cè)3 個(gè)平行數(shù)據(jù)。

1.3.7.2 乳液界面蛋白含量測(cè)定

取1 mL乳液以室溫10 000×g離心60 min，得到上下兩層，其中上層為乳析層，下層為乳清層。用帶針頭的注射器將下清層取出，并過(guò)0.22 μm的濾膜，濾液采用Lowry法以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定濾液中蛋白質(zhì)含量。界面蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式如下：

式中：Cs為用于乳液制備的初始蛋白分散液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cf為濾液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7.3 非界面蛋白組成

取1.3.7.2節(jié)得到的下清層，分別添加還原/非還原的電泳樣品緩沖液使所得樣品的蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，樣品充分振蕩并過(guò)夜。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)參考1.3.4節(jié)。

1.3.7.4 乳液電勢(shì)分析

將乳液用PBS稀釋100 倍后，采用Nano-ZS納米粒度及電位分析儀測(cè)定不同pH值條件下蛋白分散液的Zeta電位，每組測(cè)3 個(gè)平行數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以 ±s表示最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用SPSS 11.5（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)Studente Newmane Keuls（S-N-K）測(cè)試用以比較3 組實(shí)驗(yàn)均值在5%水平上是否有顯著性差異。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDA氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響

MDA可導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛性的氧化，形成蛋白質(zhì)羰基衍生物和共價(jià)交聯(lián)物[14]。由表1可知，在較低濃度的MDA（0～2.5 mmol/L）作用下，羰基含量與MDA濃度基本呈線性變化關(guān)系，說(shuō)明MDA中的一個(gè)活性羰基以1∶1加成方式與蛋白質(zhì)的伯胺反應(yīng)形成烯胺，這與Burcham等[18]的研究結(jié)果一致。而隨著MDA濃度的進(jìn)一步增加（5～10 mmol/L），羰基的增長(zhǎng)速率明顯降低，可能是由于蛋白在MDA作用下與Cys、His和Lys殘基的NH或NH2基團(tuán)，特別是與Lys殘基的ε-氨基反應(yīng)形成席夫堿而產(chǎn)生蛋白-蛋白交聯(lián)[19]，通過(guò)形成蛋白聚集體而包埋了親核側(cè)鏈。

表1 氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的影響Table 1 Effects of oxidation on protein structure and isoelectric point

如表1所示，較低濃度MDA（0～2.5 mmol/L）對(duì)SPI巰基含量的影響整體較?。≒＞0.05），其中1 mmol/L濃度MDA作用可輕微提高SPI的游離巰基含量，可能與低氧化刺激下蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)有關(guān)。而高濃度MDA（5～10 mmol/L）作用下，巰基含量顯著下降至1.8 nmol/mg（P＜0.05），損失率約32%。蛋白氧化過(guò)程中巰基會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，出現(xiàn)一定程度的損耗并形成各種氧化產(chǎn)物，如次磺酸、亞磺酸和二硫化物等，因而蛋白氨基酸側(cè)鏈在MDA作用下可因形成二硫鍵主導(dǎo)的共價(jià)交聯(lián)而導(dǎo)致巰基損失。結(jié)合羰基含量的變化結(jié)果可知，巰基的損失伴隨著羰基的生成，表明油脂氧化產(chǎn)物MDA氧化攻擊的廣泛性。

此外，隨著MDA濃度的增加，SPI的席夫堿熒光強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，并在0.1～5 mmol/L MDA濃度下呈線性增長(zhǎng)（y=683.48x+113.58，R2=0.996），表明席夫堿含量的增加。MDA是包含兩個(gè)反應(yīng)性羰基官能團(tuán)的分子，這些基團(tuán)易與蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)形成席夫堿，使分子間發(fā)生強(qiáng)交聯(lián)；同時(shí)，席夫堿熒光光譜峰值處的吸收波長(zhǎng)隨MDA作用濃度的增加而發(fā)生輕微紅移，表明蛋白所處疏水環(huán)境發(fā)生變化，可能與氧化誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)/聚集相關(guān)。

由表1可知，低濃度MDA（0～1 mmol/L）對(duì)蛋白等電點(diǎn)的影響較小，而在較高M(jìn)DA濃度（2.5～10 mmol/L）作用下，SPI的等電點(diǎn)向低pH值偏移，可能與MDA作用下帶電荷氨基酸的氧化損失（NH或NH2基團(tuán)受到氧化形成席夫堿，導(dǎo)致帶正電荷基團(tuán)的損失[20]）或因蛋白結(jié)構(gòu)聚集而導(dǎo)致的內(nèi)卷有關(guān)[21]。

2.2 MDA氧化對(duì)蛋白亞基組成的影響

圖1 經(jīng)不同濃度MDA作用后SPI的凝膠電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of SPI upon treatment with MDA at different concentrations

SPI主要由β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成[22]。7S是三聚體糖蛋白，分子質(zhì)量為150～200 kDa。組成7S的主要亞基分別為α（分子質(zhì)量約為68 kD）、α’（分子質(zhì)量約為72 kD）、β（分子質(zhì)量約為52 kD），這3 個(gè)亞基通過(guò)疏水相互作用形成三聚體。11S是一種六聚體蛋白，不含糖基，分子質(zhì)量為300～380 kDa。11S由5 個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基均由一條酸性肽鏈（A亞基，分子質(zhì)量約為35 kDa）和一條堿性肽鏈（B亞基，分子質(zhì)量約為20 kDa）通過(guò)一個(gè)二硫鍵連接而成。

由圖1可知，在非還原條件下，隨著MDA濃度的升高，170 kDa（β-伴大豆球蛋白7S，αβ2）、57 kDa（大豆球蛋白11S的AB亞基）及30 kDa（大豆球蛋白11S的A5B3亞基）的條帶濃度逐漸降低。同時(shí)，高分子質(zhì)量聚集體在凝膠頂端的積聚逐漸加深，表明蛋白受氧化而產(chǎn)生聚集，且聚集程度隨著蛋白氧化的加深而不斷增加。進(jìn)一步分析在還原條件下SPI的電泳圖，研究發(fā)現(xiàn)大部分分離膠頂端的聚集體在β-巰基乙醇作用下消失，表明聚集/交聯(lián)的形成很大程度上由二硫鍵或類似機(jī)制誘導(dǎo)。同時(shí)，聚集的11S組分解離形成的A、B亞基條帶在β-巰基乙醇作用下逐漸恢復(fù)，且與空白樣品相比并無(wú)明顯差異，表明在MDA作用下11S組分間主要形成由二硫鍵主導(dǎo)的共聚物；然而，針對(duì)7S組分，其解離形成的α’、α和β亞基條帶僅得到部分恢復(fù)，表明MDA可誘導(dǎo)7S組分同時(shí)形成二硫鍵和非二硫鍵誘導(dǎo)的聚集。此外，分離膠頂部高分子質(zhì)量區(qū)的彌散條帶強(qiáng)度仍隨著MDA濃度的升高而加深，表明高濃度MDA作用下非二硫鍵主導(dǎo)的聚集的增加。Huang Youru[23]及Wu Wei[24]等的研究也發(fā)現(xiàn)油脂氧化產(chǎn)物作用于SPI可導(dǎo)致非二硫鍵誘導(dǎo)的聚集產(chǎn)生，其中Huang Youru等[23]表明亞油酸氧化可通過(guò)增強(qiáng)蛋白分子間的疏水相互作用、氫鍵或靜電作用等非共價(jià)鍵增強(qiáng)蛋白聚集；而Wu Wei等[24]認(rèn)為這種聚集是由非二硫鍵的共價(jià)鍵引起的。結(jié)合羰基和席夫堿的結(jié)果（表1），MDA作用下非二硫鍵誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)很可能與形成的席夫堿有關(guān)。

2.3 MDA氧化蛋白對(duì)乳液結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 乳化活性及乳液表面電勢(shì)

圖2 MDA氧化蛋白對(duì)乳液粒徑分布（A）和Zeta電位（B）的影響Fig. 2 Effect of MDA-induced protein oxidation on particle size distribution (A) and zeta-potential (B) of emulsion

乳液粒徑大小可反映乳化劑的乳化活性[25]。由圖2A可知，經(jīng)MDA氧化處理的SPI制備的乳液粒徑分布差距不大，均呈現(xiàn)單峰分布；同時(shí)隨著MDA濃度的升高，各氧化樣品制備的乳液其粒徑亦無(wú)顯著差異，結(jié)果表明氧化對(duì)蛋白乳化活性影響不大。

由蛋白穩(wěn)定的乳液油滴間的靜電排斥力與相互吸引力很大程度上由蛋白結(jié)構(gòu)決定，并與乳液穩(wěn)定性密切相關(guān)。油滴表面的電荷量決定了油滴間的排斥力大小，可通過(guò)測(cè)量表面電勢(shì)反映。MDA氧化蛋白對(duì)乳液Zeta電位的影響如圖2B所示。由于乳液pH值高于蛋白等電點(diǎn)，所有乳液的Zeta電位均為負(fù)值。隨著MDA濃度的升高，蛋白乳液Zeta電位均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（絕對(duì)值升高），可能與氧化導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)變化及其等電點(diǎn)的改變相關(guān)（表1）。尤其是高濃度MDA（5～10 mmol/L）處理后，蛋白乳液的Zeta電位顯著下降（P＜0.05），與SPI的等電點(diǎn)在高濃度MDA作用下向低pH值偏移一致。

2.3.2 界面蛋白含量分析

圖3 MDA氧化蛋白對(duì)乳液界面蛋白含量的影響Fig. 3 Effect of MDA-induced protein oxidation on protein content at emuision interface

由圖3可知，未氧化處理的SPI制備的乳液其界面蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為43%，而較低濃度MDA（0.1 mmol/L）處理SPI即可顯著降低其在界面上的吸附（-11.6%，P＜0.05），可能與MDA誘導(dǎo)下蛋白聚集體的形成有關(guān)。已有研究表明，蛋白聚集體的形成可能通過(guò)位阻效應(yīng)降低其在界面的吸附[26]，而氧化作用下增強(qiáng)的蛋白分子帶電性一定程度上可增加其移動(dòng)速率。隨著MDA氧化濃度的進(jìn)一步增加，界面蛋白含量變化平緩，雖整體上有降低趨勢(shì)但各氧化濃度之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3.3 MDA氧化蛋白對(duì)乳液非界面蛋白組成的影響

圖4 SPI經(jīng)不同濃度MDA作用后乳液非界面蛋白組成的凝膠電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE pattern of SPI after treatment with MDA at different concentrations

比較氧化蛋白與乳液非界面蛋白的組分差異研究氧化蛋白對(duì)乳液界面組成的影響，由圖4可知，在非還原條件下，乳液非界面蛋白組成與氧化SPI組成（圖1）相似，但170 kDa組分條帶在2.5～10 mmol/L MDA作用下消失不見(jiàn)，同時(shí)α’和α亞基在5～10 mmol/L MDA作用下也消失不見(jiàn)，說(shuō)明在較高的氧化程度下，SPI的7S組分以及其α’和α亞基具有較好的吸附到乳液界面的能力；同時(shí)在還原條件下，和氧化SPI還原條件下的電泳圖相比，α’、α及β亞基恢復(fù)程度變小，其中α’較α及β更易受MDA影響，而且在MDA濃度為10 mmol/L時(shí)，α’亞基條帶消失，說(shuō)明此時(shí)α’亞基全部吸附到了乳液界面上。上述結(jié)果表明，各濃度MDA處理SPI對(duì)乳液界面蛋白組分影響較大，在經(jīng)高濃度MDA氧化后更多7S組分以聚集狀態(tài)參與了界面蛋白組成，其中以α’組分吸附到乳液界面的能力最強(qiáng)。

2.4 MDA氧化蛋白對(duì)乳液消化特性的影響

2.4.1 乳液消化動(dòng)力學(xué)

圖5 乳液消化動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 5 Digestion kinetic curve of emulsions stabilized by oxidized SPI

通過(guò)比較游離脂肪酸釋放速率及程度可以分析乳液的脂質(zhì)消化特性。由圖5可知，未經(jīng)MDA氧化的SPI制備的乳液經(jīng)消化后釋放的游離脂肪酸程度最高，釋放率約為34.8%。經(jīng)0.1 mmol/L MDA處理的SPI制備的乳液釋放率顯著降低（P＜0.05），但在0.1～2.5 mmol/L區(qū)間內(nèi)并無(wú)顯著變化（P＞0.05）。隨著MDA濃度的進(jìn)一步升高，游離脂肪酸釋放率明顯降低并在10 mmol/L達(dá)到最低（約27%）。大量的研究表明，胃腸道中的脂肪酶必須吸附至乳滴表面才可展開(kāi)并暴露其作用位點(diǎn)，進(jìn)而與油脂接觸啟動(dòng)水解過(guò)程。因而蛋白結(jié)構(gòu)的改變可通過(guò)改變?nèi)橐航Y(jié)構(gòu)，影響界面蛋白吸附層與脂肪酶的交互作用，進(jìn)而改變油脂的消化進(jìn)程[27-28]。已有研究表明，7S組分可以形成高黏彈性的界面膜[29]，從而阻止或減緩脂肪酶與油脂的接觸。MDA誘導(dǎo)的氧化作用下，7S組分間可形成以二硫鍵及席夫堿共誘導(dǎo)的強(qiáng)共價(jià)交聯(lián)，結(jié)合乳液非界面蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果，隨著MDA濃度的升高，更多聚集狀態(tài)的7S組分參與界面組成，可增強(qiáng)界面剛性及致密性，一定程度上可減緩脂肪酶與油脂的接觸，進(jìn)而降低乳液脂質(zhì)釋放率。

已有研究表明，膽鹽是脂質(zhì)消化中的關(guān)鍵性物質(zhì)，它通過(guò)替代界面的表面活性物質(zhì)促進(jìn)脂肪酶和乳液界面層的結(jié)合，從而加快脂質(zhì)的消化[30]。研究進(jìn)一步對(duì)所獲得的消化動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行非線性擬合，以期通過(guò)對(duì)擬合曲線求導(dǎo)獲得各時(shí)間點(diǎn)的消化速率。由于脂質(zhì)的初始消化速率在很大程度上可以影響消化進(jìn)程，本實(shí)驗(yàn)主要探究蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)乳液消化初始速率的改變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述所有蛋白乳液的消化曲線經(jīng)擬合均符合下列方程：

式中：y為游離脂肪酸釋放率；x為時(shí)間；a、b、c均為擬合參數(shù)。對(duì)上述方程求導(dǎo)，其x=0點(diǎn)處的值即為乳液消化的起始速率，各MDA濃度作用SPI后制備的乳液的消化起始速率如圖6所示。乳液的起始消化速率隨著MDA濃度的升高而降低，并在0～10 mmol/L內(nèi)符合指數(shù)遞減方程（2.5 mmol/L MDA之后變化趨于平穩(wěn)）：

結(jié)果表明乳液界面上的蛋白交聯(lián)/聚集體減弱了膽鹽在脂質(zhì)消化中的作用，使得脂質(zhì)的初始消化速率降低。Maldonado-Valderrama等[31]研究發(fā)現(xiàn)高黏彈性的界面膜能夠阻礙膽鹽的替換行為。故MDA濃度的升高引起更多聚集狀態(tài)的7S組分參與界面組成，使得界面黏彈性增加，進(jìn)而阻礙膽鹽的替換行為，降低脂質(zhì)的初始消化速率。

圖6 MDA氧化蛋白對(duì)乳液初始消化速率的影響Fig. 6 Effect of MDA-induced protein oxidation on the initial digestion rate of emulsion

綜上結(jié)果表明，MDA氧化蛋白會(huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變?nèi)橐航缑娴鞍捉Y(jié)構(gòu)及組分，氧化誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)/聚集可延緩或降低膽鹽在界面的替代，進(jìn)而減緩乳液消化并降低乳液脂質(zhì)釋放率。

2.4.2 乳液消化穩(wěn)定性

圖7 MDA氧化蛋白對(duì)乳液消化穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of MDA-induced protein oxidation on the digestion stability of emulsion

由圖7可知，與未消化樣品相比（圖2A），經(jīng)體外胃消化后，乳液的粒徑基本不變（圖7a）。Bellesi等[32]研究發(fā)現(xiàn)，SPI在油水界面不易被胃蛋白酶水解，并且在模擬胃消化結(jié)束后乳液界面結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。經(jīng)小腸消化后，乳液的粒徑分布逐漸呈多峰分散狀態(tài)（圖7b）。乳液的消化主要在小腸中進(jìn)行，此階段發(fā)生的一系列復(fù)雜的變化，比如膽鹽吸附到界面、膽鹽和界面膜的相互作用、胰脂酶的吸附和脂質(zhì)水解、界面電勢(shì)的改變、消化產(chǎn)物的積累等，導(dǎo)致乳液狀態(tài)產(chǎn)生較大變化[32]。粒徑分布隨著MDA濃度的提高不斷右移，平均粒徑不斷增加，表明油滴在消化過(guò)程發(fā)生了一定程度的聚結(jié)。可能是由于消化過(guò)程油滴的聚結(jié)導(dǎo)致比表面積變小，使得與脂肪酶接觸的表面積變小，進(jìn)而一定程度上降低了乳液脂質(zhì)釋放率。

3 結(jié) 論

SPI在MDA的作用下會(huì)發(fā)生氧化交聯(lián)/聚集，且隨MDA濃度的提高，蛋白氧化程度加深。其中蛋白11S組分主要形成由二硫鍵主導(dǎo)的共聚物。7S組分同時(shí)形成由二硫鍵和非二硫鍵誘導(dǎo)的共聚物。

不同濃度MDA氧化處理SPI對(duì)乳液的粒徑分布和界面蛋白含量影響不大，但對(duì)界面蛋白的組成影響較大，其中經(jīng)高濃度MDA氧化后，更多7S組分以聚集狀態(tài)參與了界面蛋白組成，使得界面層黏彈性和剛性增強(qiáng)，阻止脂肪酶與油脂的接觸，并降低或延緩了膽鹽替代界面蛋白的程度，進(jìn)而降低了乳液的消化程度和起始消化速率。

因此，大豆蛋白經(jīng)過(guò)脂質(zhì)次級(jí)氧化產(chǎn)物的氧化作用，結(jié)構(gòu)發(fā)生交聯(lián)聚集，使得乳液結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，并使乳液具備了抗消化的特性。