預(yù)處理對(duì)ABO血型不相合腎移植受者免疫功能的影響

王顯丁 劉金鵬 李亞梅 徐子林 呂遠(yuǎn)航 宋涂潤(rùn) 蔣亞梅 范 鈺 黃春妍 王 莉 林 濤

腎移植是終末期腎病(ESRD)的最佳治療方式［1］。目前，短缺的供腎遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足ESRD患者對(duì)腎移植的需求。為了擴(kuò)大供腎來(lái)源，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)探索出固定的預(yù)處理方案，使ABO血型不相合(ABOi)活體腎移植成為現(xiàn)實(shí)［2－5］。

T細(xì)胞、B細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫球蛋白和補(bǔ)體在移植腎排斥反應(yīng)及感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是腎移植受者免疫狀態(tài)的重要評(píng)估指標(biāo)［6－9］。但ABOi腎移植對(duì)外周血淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響仍不清楚。因此，我們進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，通過(guò)比較ABO血型相合(ABOc)和ABOi腎移植受者外周血淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子及免疫球蛋白的變化，探究ABOi腎移植及其預(yù)處理對(duì)受者免疫狀態(tài)的影響。

對(duì)象和方法

研究人群 選取2014-09-12～2018-11-11華西醫(yī)院泌尿外科采用基于受者初始血型抗體效價(jià)的個(gè)體化預(yù)處理方案，已成功開展ABOi腎移植55例，并取得良好的臨床結(jié)果。納入2018年3月至2018年9月在華西醫(yī)院接受ABOi活體腎移植的9例受者及同時(shí)期ABOc受者18例。所有供受者均成年，其關(guān)系為直系親屬或配偶，所有供腎者系自愿、無(wú)償將其一側(cè)腎臟捐獻(xiàn)給受者，并經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)和四川省衛(wèi)生健康委員會(huì)審批同意。

研究方案 本研究將納入人群分為兩組:ABOi組(n=9例)及ABOc組(n=18例)，檢測(cè)受者預(yù)處理前后、移植前后T細(xì)胞和B細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子、免疫球蛋白和補(bǔ)體的水平，比較兩組受者免疫狀態(tài)的變化差異，評(píng)估ABOi腎移植及其預(yù)處理對(duì)受者短期免疫狀態(tài)的影響。

個(gè)體化預(yù)處理及免疫抑制方案 對(duì)于初始血型抗體(IgG和IgM)效價(jià)≤1∶8的受者，在移植前僅口服免疫抑制劑進(jìn)行預(yù)處理;初始血型抗體效價(jià)等于1∶16的受者，采用口服免疫抑制劑+血漿置換/雙重血漿濾過(guò);對(duì)于初始血型抗體效價(jià)≥1∶32的受者，采用口服免疫抑制劑+利妥昔單抗+血漿置換/血漿雙重濾過(guò)，以保證移植當(dāng)天血型抗體效價(jià)≤1 ∶8～16［10－12］。

ABOi受者在移植前2～4周開始口服他克莫司(Tac)+嗎替麥考酚酯(MMF)/嗎替麥考酚鈉(ECMPS)+潑尼松。Tac初始劑量為3 mg/d，MMF初始劑量為2 000 mg/d(EC-MPS為1 440 mg/d)，潑尼松為5 mg/d，根據(jù)Tac及霉酚酸的血藥濃度調(diào)整劑量。根據(jù)受者免疫風(fēng)險(xiǎn)選擇不同的免疫誘導(dǎo)藥物。移植當(dāng)天停用Tac和潑尼松，術(shù)中靜脈注射甲潑尼龍500 mg，術(shù)后1～3d靜脈注射甲潑尼龍200 mg/d，術(shù)后第4天改用口服潑尼松60 mg/d，逐漸減量，維持劑量為0～10 mg/d。術(shù)后第2天重新開始口服Tac，Tac谷濃度維持在 5～10 μg/L，霉酚酸藥時(shí)曲線下面積維持在30～60(mg·h)/L。

ABOc受者移植前一天晚上開始口服MMF/ECMPS，MMF初始劑量為 2 000 mg/d(EC-MPS為1 440 mg/d)，術(shù)中靜脈注射甲潑尼龍500 mg，術(shù)后1～3天靜脈注射甲潑尼龍200 mg/d，術(shù)后第4天改用口服潑尼松60 mg/d，逐漸減量，維持劑量為0～10 mg/d，術(shù)后第二天開始口服Tac，Tac初始劑量為3 mg/d，Tac和霉酚酸維持濃度同ABOi受者。所有受者在移植前均無(wú)供者特異性HLA抗體。

預(yù)防感染方案:所有受者手術(shù)當(dāng)天至術(shù)后1周靜脈給予二代頭孢預(yù)防細(xì)菌感染，術(shù)后2周左右受者開始口服磺胺預(yù)防肺孢子菌感染，預(yù)防用藥9個(gè)月;有條件的患者可以口服纈更昔洛韋預(yù)防病毒感染。

檢測(cè)指標(biāo) ABOi組中，對(duì)于未使用利妥昔單抗的受者在預(yù)處理前，手術(shù)當(dāng)天，術(shù)后1周，術(shù)后2周，術(shù)后1月檢測(cè)血型抗體效價(jià)、T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(CD3+、CD4+、CD8+)、B 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù) (CD19+CD5+)、細(xì)胞因子［白細(xì)胞介素2(IL-2)受體、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)］、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgG4)和補(bǔ)體(C3、C4、備解素因子 B)水平;使用利妥昔單抗的患者在用利妥昔單抗前、使用后1周，移植當(dāng)天，術(shù)后1周，術(shù)后2周，術(shù)后1月檢測(cè)上述指標(biāo)。ABOc組受者在術(shù)前，術(shù)后1周，術(shù)后2周，術(shù)后1月檢測(cè)上述指標(biāo)。檢測(cè)受者移植后3天、1周、2周、1月血清肌酐(SCr)水平和估算腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR);排斥反應(yīng)和感染的發(fā)生率。受者eGFR采用MDRD公式計(jì)算。

檢測(cè)方法 T細(xì)胞、B細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)和T細(xì)胞亞群的檢測(cè):檢測(cè)樣本來(lái)自腎移植受者不同時(shí)點(diǎn)的肝素抗凝外周全血。嚴(yán)格按照四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行檢測(cè)，采用流式細(xì)胞術(shù)(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACSCanto II流式細(xì)胞儀)的方法檢測(cè)T、B細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)，CD19+CD5+B細(xì)胞百分比和CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群百分比。使用的流式抗體主要有:美國(guó)BD公司CD3-PerCP，CD4-FITC，CD8-APC-Cy7。于流式上樣管中分別加入 CD3 3 μl、CD4 3 μl，CD8 3 μl，抗體和肝素 50 μl抗凝全血，充分混勻后于4℃避光環(huán)境中孵育30 min，加入 2ml溶血?jiǎng)?NH4CL，0.15 mol/L)，充分混勻后室溫靜置溶血10 min，PBS洗滌并重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞因子IL-2受體，IL-8，TNF-α的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑(德國(guó)西門子公司，IMMULITE 1000);IL-6的檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑(Roche，e601)。速率散色比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白IgG，IgA，IgM，IgE和C3，C4，備解素因子B的水平(Beckman-counlter公司，IMMAGE 800全自動(dòng)免疫濁度分析儀);免疫球蛋白IgG4采用定時(shí)散色比濁的方法(德國(guó)西門子公司，BN II)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用《SPSS 22.0(IBM，USA)》統(tǒng)計(jì)軟件，連續(xù)性變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量用絕對(duì)或相對(duì)率描述。連續(xù)變量間的比較采用獨(dú)立樣本Student's t檢驗(yàn)，分類變量的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組患者基線資料 兩組受者及其供者的基線特征均無(wú)差異(P＜0.05，表1)。受者中位隨訪時(shí)間127d(31～227d)。

表1 兩組供受者基線資料

ABOi組受者個(gè)體化預(yù)處理方案及血型抗體效價(jià)變化 ABOi組9例受者均在術(shù)前1月開始口服免疫抑制劑，3例受者接受利妥昔單抗200 mg+1次雙重血漿濾過(guò)，2例受者接受利妥昔單抗200 mg+2次雙重血漿濾過(guò)，2例受者接受利妥昔單抗300 mg+2次雙重血漿濾過(guò)，1例受者接受利妥昔單抗300 mg+4次雙重血漿濾過(guò)，1例受者接受利妥昔單抗200 mg+1次血漿置換+2次雙重血漿濾過(guò)。所有受者移植當(dāng)天血型抗體效價(jià)≤1∶16，所有受者移植后2周內(nèi)密切監(jiān)測(cè)血型抗體效價(jià)，術(shù)后2周內(nèi)血型抗體效價(jià)反彈均不超過(guò)1∶16。受者血型抗體水平變化如圖1所示。

圖1 ABO血型不相合(ABOi)組受者血型抗體效價(jià)IgG和IgM變化(平均值

兩組受者外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫球蛋白和補(bǔ)體水平的比較 ABOi組受者外周血初始C3水平顯著高于ABOc組(0.74±0.14 g/L vs 0.56±0.07 g/L，P=0.03)，兩組受者初始 T 細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、B細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子、免疫球蛋白、C4和備解素因子B水平均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05);ABOi組受者在術(shù)后7d、14d及1個(gè)月時(shí)外周血B細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于ABOc組受者(2.56±2.40 cell/μl vs 342.06±216.59 cell/μl，P ＜ 0.001;11.67±19.02 cell/μl vs 273.42±221.07 cell/μl，P=0.002;1.50±1.73 cell/μl vs 363.75±385.82 cell/μl，P=0.03);ABOi組受者術(shù)后7天IgG、IgA及IgM水平顯著低于 ABOc組(6.90±1.75 g/L vs 10.18±2.50 g/L，P=0.002;1 355.55±502.11 mg/L vs 2 169.44±719.71 mg/L，P=0.006;650.44±340.08 mg/L vs 1 008.83±448.15 mg/L，P=0.04);其余各項(xiàng)指標(biāo)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

ABOi組受者B細(xì)胞計(jì)數(shù)在使用利妥昔單抗7d后明顯降低，并維持至術(shù)后1月，而ABOc組受者則一直趨向平穩(wěn)(圖2)。ABOc組受者外周血IgG、IgA及IgM水平在移植前后并未發(fā)生顯著改變，而ABOi組受者IgG、IgA及IgM在預(yù)處理后至移植當(dāng)天顯著下降，直至術(shù)后1月恢復(fù)至初始水平(表3)。

圖2 兩組受者B細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)

兩組受者短期移植效果 兩組受者短期腎功能如表4所示，兩組并沒(méi)有差異(P＞0.05)。隨訪期間沒(méi)有患者死亡，沒(méi)有發(fā)生移植腎丟失、排斥反應(yīng)及感染。

討 論

本研究通過(guò)比較ABOi和ABOc腎移植受者外周血T細(xì)胞和B細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子、免疫球蛋白和補(bǔ)體水平，發(fā)現(xiàn)ABOi受者經(jīng)過(guò)血型不合預(yù)處理后外周血B細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著持續(xù)減少，IgG、IgA及IgM水平短暫下降后恢復(fù)至ABOc受者水平，血型不相合并不影響腎移植受者外周血T細(xì)胞、細(xì)胞因子及補(bǔ)體水平，兩組受者短期腎功能、存活率、排斥、感染發(fā)生率均沒(méi)有顯著差異。

淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子在腎移植免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD3是T細(xì)胞表面標(biāo)志物，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞活化信號(hào)，CD3+T細(xì)胞間接表示T淋巴細(xì)胞總數(shù)。T細(xì)胞經(jīng)抗原信號(hào)刺激后活化為CD4+和CD8+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞具有識(shí)別外來(lái)抗原、放大免疫反應(yīng)、協(xié)同活化CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能，CD8+T細(xì)胞則有細(xì)胞殺傷作用［13－14］。B 細(xì)胞在抗原刺激下活化為漿細(xì)胞，繼而產(chǎn)生免疫球蛋白，包括血型抗體，其與抗原形成抗原-抗體復(fù)合物，沉積于移植腎小管和內(nèi)皮表面，是體液免疫反應(yīng)的終末部分［8，15］。細(xì)胞因子和補(bǔ)體參與免疫和炎癥反應(yīng)，是急性感染和機(jī)體免疫反應(yīng)的重要組成［9，16］。

?

本研究中ABOi受者均接受利妥昔單抗和雙重血漿濾過(guò)。利妥昔單抗使受者外周血B細(xì)胞快速減少，并可較長(zhǎng)時(shí)間維持B細(xì)胞的低水平狀態(tài)。血漿置換和雙重血漿濾過(guò)清除受者血漿中血型抗體的同時(shí)，也一定程度上清除血漿中免疫球蛋白，引起外周血免疫球蛋白減少，但移植術(shù)后不再進(jìn)行血漿置換和雙重血漿濾過(guò)后，受者血漿中免疫球蛋白將再次升高至正常水平。在本研究中ABOi腎移植并沒(méi)有改變受者的外周血T細(xì)胞、各種細(xì)胞因子及補(bǔ)體水平，未對(duì)受者短期免疫狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響，與免疫狀態(tài)密切相關(guān)的排斥反應(yīng)的發(fā)生并無(wú)變化。B細(xì)胞可作為抗原呈遞細(xì)胞，是T細(xì)胞活化的重要組成部分，清除B細(xì)胞后，ABOi受者體內(nèi)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)均受損，但經(jīng)過(guò)有效地抗感染預(yù)防，兩組受者短期內(nèi)均未發(fā)生感染事件。ABOi腎移植并不會(huì)增加排斥反應(yīng)和感染的短期發(fā)生率。

這是我國(guó)第一個(gè)評(píng)估ABOi腎移植受者免疫狀態(tài)的研究，填補(bǔ)了我國(guó)ABOi腎移植相關(guān)研究空白。完善ABOi受者免疫狀態(tài)的評(píng)估，為更多的ABOi受者預(yù)后提供進(jìn)一步保障，也為及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷和治療排斥反應(yīng)及感染奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在我們的研究中，ABOi與ABOc受者免疫狀態(tài)相近，使開展ABOi腎移植更具說(shuō)服力。

本研究缺點(diǎn)是隨訪時(shí)間過(guò)短，樣本量較小，在本研究期間尚未出現(xiàn)排斥反應(yīng)和感染事件，我們的研究更多的是反映ABOi腎移植受者免疫指標(biāo)變化的趨勢(shì)，但這種變化趨勢(shì)和排斥反應(yīng)及感染之間的聯(lián)系，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間才能明確。

通過(guò)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的研究，我們發(fā)現(xiàn)ABOi腎移植受者外周血B細(xì)胞顯著減少，IgG、IgA及IgM水平短暫下降，但T細(xì)胞、細(xì)胞因子及補(bǔ)體水平并不受影響，經(jīng)過(guò)有效抗感染預(yù)防，ABOi腎移植未增加短期內(nèi)排斥反應(yīng)和感染的發(fā)生。