豬瘟單克隆抗體診斷技術(shù)的推廣與應(yīng)用

麥麗芳

（廣東省惠州仲愷高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心 516006）

1 單克隆抗體的主要作用

20 世紀初期，細胞融合技術(shù)得到第一個單克隆抗體，單抗的問世為各種病害的診斷、預防和治療提供了強有力的技術(shù)措施。經(jīng)試驗比較可以發(fā)現(xiàn)，單抗純度高、活性單一，與抗原結(jié)合后能無限繁殖，形成強的特異性，可識別多種新型表位，可識別抗原等優(yōu)點，在治療性候選藥物及診斷試劑盒開發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

2 豬瘟疫情介紹

2.1 流行病學

豬為豬瘟唯一易感群體，致病病毒可隨糞便、分泌物等排到體外，散布在外界形成傳染載體。近些年，典型豬瘟病例漸少，而非典型性豬瘟占大多數(shù)。臨床表現(xiàn)持續(xù)感染，隱性傳染，混合感染。妊娠母豬感染，多數(shù)癥狀不突出。但會伴發(fā)明顯的繁殖障礙病。

2.2 臨床癥狀

急性：發(fā)病急，高熱稽留，突然發(fā)病。多數(shù)發(fā)病后 1～2d即可死亡。此病流行初期便秘，后期下痢。檢查排出糞便有大量血絲或黏液。個別病例伴發(fā)典型神經(jīng)癥狀。

慢性：臨床以纖維性壞死性腸炎為典型癥狀，癥狀較急性類似，但癥狀時好時壞?？梢姲Y狀食欲不振、貧血、消瘦，便秘與腹瀉交替出現(xiàn)，皮膚有大小不等的壞死斑。多數(shù)病程在30d 以上，個別病例因體質(zhì)問題導致病情惡化甚至死亡。

2.3 豬瘟的檢測

獸醫(yī)在豬瘟臨床診斷中主要根據(jù)測試體溫、臨床發(fā)病情況、特點、傳播方式、易感動物、死后剖檢觀察的病理變化可做初步診斷。而確診需要結(jié)合實驗室診斷而進行，參見附表。

通常情況下，豬瘟免疫控制階段以血清學檢測為主，監(jiān)測凈化階段以病原學檢測為主?？贵w檢測用于了解機體免疫功能及豬瘟的免疫保護水平，病原學檢測用于確診豬瘟病毒野毒感染。血清學檢測方法優(yōu)先選用ELISA 方法或其他經(jīng)試劑比對和有效驗證可靠的方法。病原學檢測應(yīng)選用敏感性等于或高于RT-PCR 的方法。

諸多檢測應(yīng)用方法中，豬瘟單克隆抗體在豬瘟防疫各階段應(yīng)用的頻率最大，而且取得優(yōu)于多克隆抗體的監(jiān)測效果。

附表 豬瘟診斷指標和發(fā)病情況匯總表

3 關(guān)于豬瘟單克隆抗體

抗體是分子識別的重要載體，被普遍應(yīng)用到各豬病的診斷實踐中。而單克隆抗體是通過將抗原注入宿主動物體內(nèi)啟動機體免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的。因而制作單克隆抗體的大多數(shù)操作都是在體外將來自這些宿主的脾細胞與培養(yǎng)的惡性骨髓瘤細胞進行融合。將獨特的細胞克隆分離出來，融合步驟中存活下來的細胞稱為雜交瘤。雜交瘤因骨髓瘤特性而可以永生，且容易在培養(yǎng)物中繁殖。

不同于多克隆抗體，單克隆抗體用于豬瘟診斷體現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)越性：第一，在體外生存環(huán)境中，雜交瘤存活時間更長，在傳代生長中能持續(xù)形成高均一、高特異抗體。第二，提純不純抗原，獲得高特異的抗體，提升識別檢測的準確性。第三，能獲得無限量的均一抗體，尤其適合抗體標記的免疫學分析，區(qū)別于多克隆抗體檢測效果更好。

但也有缺點，第一，單克隆抗體制備成本更高些，技術(shù)更復雜，篩選難度更大，使用價格更高。第二，單克隆抗體診斷技術(shù)存在明顯的局限性，生物活性的親和性和局限性大大限制其應(yīng)用范圍，尤其不能用于沉淀和凝聚反應(yīng)的實驗室診斷。

4 豬瘟單克隆抗體診斷技術(shù)的推廣

4.1 基于豬瘟單克隆抗體的豬瘟抗原診斷

張富強等以單克隆抗體為包被抗體，以噬體表位為競爭指示劑，以標記HRP 為檢測抗體，由此而建立起的競爭ELISA方法。在后續(xù)推廣試驗中，用于70 份的血清樣品監(jiān)測，證實較國家標準的抗原捕捉ELISA 方法敏感性更高。同時，推廣應(yīng)用的試劑中很多不含有病毒成分，不具有傳染性，可作為常規(guī)檢測方法加以推廣。張長弓等用膠體金標識單克隆抗體研發(fā)豬瘟膠體金快速監(jiān)測技術(shù)。在推廣試驗中，該試紙用于弱毒活疫苗和脾淋弱毒苗的檢測，均顯示為陽性。而其他豬源病毒的檢測均顯示陰性，證實該試紙用于豬瘟抗原診斷的高敏性。此外，考慮到該單克隆抗體與野毒有很大區(qū)別，為在區(qū)分野毒抗體方面存在很大差異[1]。陸芹章等用CSFV 單克隆抗體成立抗原診斷方法。在比較一元和二元單抗的檢測比較中很好地證實二元的協(xié)作能力更強，更有利于捕捉病毒，用于鑒別診斷。De las Mulas 等及Narita 等利用針對E2 糖蛋白的單抗建立了檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品中豬瘟病毒抗原的免疫組織化學方法。該方法的優(yōu)點是能檢測長期保存的樣品，缺點是比較費時，而且福爾馬林固定后的組織不能再進行病毒分離[2]。劉建文等以3 株CSFV 特異性單抗聯(lián)合作為捕捉抗體，建立了檢測CSFV 抗原的AC-ELISA，單抗的聯(lián)合應(yīng)用提高了該方法的敏感性，對31 份臨床樣品進行平行檢測，該方法與病毒分離和RT-PCR 方法的符合率分別為86.2%和90.3%。該方法將單抗特異性和ELISA 方法的敏感性有機地結(jié)合起來，能短時間內(nèi)準確、快速、直接檢測大批量樣品中CSFV 抗原，且明顯優(yōu)于病毒分離和免疫熒光等方法，更適合于各級獸醫(yī)研究機構(gòu)和生產(chǎn)單位應(yīng)用。由于3 株單抗與BVDV 無交叉反應(yīng)性，也可達到與BVDV 鑒別診斷的目的。

4.2 基于豬瘟單克隆抗體的豬瘟抗體診斷

劉勁松等用酶標記CSFV 抗體建立的競爭ELISAD 法，試驗用5 份未吃乳仔豬血清和79 份疫苗注射不同生豬的血清監(jiān)測。結(jié)果顯示，注射前血清母源抗體抑制率在50.8%，注射后2 周母源抗體抑制率在60.8%，與HRP-SPA-ELISA 的檢測結(jié)果呈正相比關(guān)系。由此可見，豬瘟病毒抗體檢測能準確反應(yīng)疫苗注射前后抗體水平和免疫水平。梁冰冰等用豬瘟重組E2 蛋白作為競爭抗體，建立一種能有效檢測抗體的E2 蛋白競爭抑制ELISA 方法。經(jīng)試驗比較，該檢測結(jié)果與IDEXX 公司的試劑檢測吻合度高達90%以上。同時，測得的抑制率更呈正相關(guān)。由此可證實，E2 蛋白競爭抑制ELISA 方法，能更高效定量檢測出免疫后的中和抗體水平，適合用于初期抗體水平的流行情況檢測。國外學者Claqvijo 等嘗試用豬瘟E2 基因表達產(chǎn)物制備單克隆抗體，經(jīng)該種方法成立的競爭ELISA 方法在臨床試驗比較的2000 多份血清檢測中證實有效的特異性反應(yīng)和敏感性反應(yīng)分別達到100%和85%。另外，考慮到該單抗不具備中和性，可用此法推廣到豬瘟病的監(jiān)測和流行病學調(diào)查。