CXCR4基因沉默對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡及遷移能力的影響

陳 爍， 龔銀銀， 顏景穎， 汪慧敏， 冉 云， 張 濤

在我國(guó)，膀胱癌的發(fā)病率位居惡性腫瘤的第5位，位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第1位，且復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%[1]。因此，探討膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找可靠的生物學(xué)標(biāo)志物和有效的基因治療靶點(diǎn)，對(duì)提高膀胱癌患者的生存率顯得尤為重要[2]。研究認(rèn)為，CXCR4基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。本研究擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)CXCR4基因的表達(dá)水平，觀察CXCR4基因表達(dá)下調(diào)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡、遷移功能方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細(xì)胞株(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；兔抗人CXCR4抗體(美國(guó)R&D公司)；轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；10%的胎牛血清(杭州四季青公司)；噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Sigma公司)；Transwell小室(美國(guó)Costar公司)；Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒液由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科王天寶教授饋贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 在無(wú)菌條件下，將人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株置于含有10%胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素+青霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞以每孔5×105個(gè)的密度接種在6孔板中；次日，當(dāng)T24細(xì)胞濃度達(dá)50%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將T24細(xì)胞分為3組：(1)干擾組，應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)載體Lipofectamine 2000將小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后，更換含血清及抗生素的培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)；(2)陰性對(duì)照組，將轉(zhuǎn)染siRNA空載體作為陰性對(duì)照組；(3)空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何處理。

1.2.2Western-blot檢則 取80 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉1 h，加入用0.05%的Tween 20 TBS緩沖液稀釋的CXCR4蛋白抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBS緩沖液漂洗3次，加入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)中，37 ℃下溫育1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色和拍照。采用相關(guān)軟件分析各條帶光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)作為該蛋白質(zhì)的表達(dá)含量。

1.2.3檢測(cè)細(xì)胞的死亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×105mL-1，接種于24孔培養(yǎng)板中，分別于轉(zhuǎn)染24,48及72 h后收取細(xì)胞，3 200 r/min離心3 min，以適量體積重懸，用0.04%臺(tái)盼藍(lán)溶液與等體積細(xì)胞懸液混勻3 min，計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。

細(xì)胞死亡率(%)=死細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%

1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) (1)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將密度為2×105mL-1的T24細(xì)胞移到96孔板中培養(yǎng)，每孔加入100 μL的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS)，于37 ℃水浴孵育5 min或室溫放置25 min。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。分別于CCK-8溶液加入后的0，24，48和72 h測(cè)定不同處理的T24細(xì)胞的光密度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將T24細(xì)胞以每孔1×105mL-1的密度種植于6孔板中，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min下離心5 min，PBS清洗2次，Binding Buffer清洗1次，1 000 r/min下離心5 min。Binding Buffer 500 μL重懸細(xì)胞，避光加入5 μL Annexin V，室溫避光作用15 min。加入5 μL 7-氨基放線菌素D(7-amino-actinomycin D,7-AAD)，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 取100 μL T24細(xì)胞懸液加入到Transwell小室，下室加入500 μL的10% FBS培養(yǎng)基，再放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞遷移情況。將Transwell小室取出，用棉棒將上室內(nèi)的明膠基質(zhì)擦去，用PBS清洗3遍，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，再用PBS溶液清洗干凈后，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS液清洗，吹干。顯微鏡隨機(jī)挑選10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1siRNA干擾對(duì)T24細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染72 h后，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，3組細(xì)胞均不同程度表達(dá)CXCR4，干擾組明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01，圖1)。

A：Western-blot檢測(cè)3組CXCR4蛋白的電泳圖譜,1,2,3分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組；B：3組T24細(xì)胞CXCR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量，與其他兩組比較，☆☆：P<0.01.圖1 siRNA干擾對(duì)T24細(xì)胞中CXCR4蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Expression of CXCR4 on T24 cells after siRNA interference

2.2siRNA 干擾對(duì)T24細(xì)胞死亡的影響 轉(zhuǎn)染siRNA后24，48和72 h后，干擾組的T24細(xì)胞死亡率高于空白對(duì)照組(P<0.05)，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，差別則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1CXCR4基因沉默后不同時(shí)間T24細(xì)胞死亡率的變化

Tab 1Rate of cell death on T24 cell at different times after silencing of CXCR4 gene

分 組t轉(zhuǎn)染/h244872空白對(duì)照組2.312±0.6513.205±0.4574.431±0.983陰性對(duì)照組2.293±0.4824.212±0.4845.589±0.616干擾組4.805±0.711#15.568±0.913#40.146±2.152☆

n=3. 表中數(shù)據(jù)為%. 與空白對(duì)照組比較，☆：P<0.05.

2.3siRNA干擾后對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染siRNA 24，48和72 h后，陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組和干擾組的膀胱癌細(xì)胞系增殖速率分別為[(0.99±0.4)，(0.98±0.4)，(0.65±0.2)；(2.36±0.4)，(2.28±0.4)，(1.32±0.3)；(3.59±0.2)，(3.39±0.3)，(1.83±0.4)]，3組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

3組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.001.圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后抑制膀胱癌T24細(xì)胞系的增殖Fig 2 The proliferation of T24 bladder cancer cells after siRNA transfection

2.4siRNA干擾后對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 干擾組的凋亡率為(63.66±5.7)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較[(18.4±2.6)%，(20.2±3.1)%]，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

A：空白對(duì)照組； B：陰性對(duì)照組； C：干擾組.圖3 雙染法流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的凋亡率Fig 3 Apoptosis rate of different groups

2.5siRNA干擾后對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞遷移侵襲能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，每高倍鏡視野下，干擾組的細(xì)胞數(shù)目顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(圖4A～C)。T24細(xì)胞空白對(duì)照組(234.6±23.4)個(gè)、陰性對(duì)照組(210.7±20.9)個(gè)，明顯高于干擾組的(84.9±17.5)個(gè)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4D)。

A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：干擾組；D：統(tǒng)計(jì)柱狀圖. 與其他兩組比較，☆☆：P<0.01.圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)分析siRNA對(duì)T24腫瘤細(xì)胞侵襲的影響Fig 4 Cell invasion of siRNA on T24 bladder cancer cell

3 討 論

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段的綜合過(guò)程。趨化因子家族因其為刺激新血管形成提供關(guān)鍵信號(hào)，以及促成細(xì)胞成熟和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和凋亡的特殊功能，目前已成為膀胱癌基因新的研究熱點(diǎn)[5]。趨化因子CXCL12是趨化因子CXC家族中的一員，又名基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)，是一種造血過(guò)程和骨髓移植術(shù)后骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是T細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子，在肺、肝、骨髓和淋巴結(jié)等器官中高表達(dá)[6]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的基質(zhì)中含有大量CXCL12，并且在部分腫瘤細(xì)胞株中可以檢測(cè)到CXCL12的表達(dá)[7]。CXCR4是目前唯一已知的CXCL12受體，介導(dǎo)CXCL12的趨化作用。當(dāng)前普遍認(rèn)為，CXCR4的表達(dá)是惡性腫瘤的一個(gè)重要特征，可作為判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一[8]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12/CXCR4對(duì)胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要作用[9-11]。Guembarovski等發(fā)現(xiàn)，CXCL12/CXCR4系統(tǒng)在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有明顯作用，表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞可以在CXCL12的趨化影響下向周圍或遠(yuǎn)端組織侵襲并形成轉(zhuǎn)移灶[12]。此外，CXCR4在骨肉瘤和肺癌中表達(dá)升高[13-14]。Akashi等采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)前列腺癌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCR4蛋白表達(dá)升高與腫瘤的轉(zhuǎn)移正相關(guān)[15]。筆者在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，CXCL12能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲，抑制其受體CXCR4表達(dá)后，可逆轉(zhuǎn)CXCL12對(duì)骨肉瘤遷移和侵襲的促進(jìn)作用，表明CXCR4基因?qū)侨饬龅那忠u和遷移起重要調(diào)節(jié)作用[16]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CXCR4基因也可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。葉明寶等檢測(cè)了118例膀胱癌組織和癌旁組織標(biāo)本的SDF-1/CXCR4、PD-L1/PD-1以及細(xì)胞凋亡相關(guān)分子、細(xì)胞侵襲相關(guān)分子的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4與負(fù)性共刺激分子PD-L1、促增殖分子、促侵襲分子的高表達(dá)密切相關(guān)，SDF-1/CXCR4能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的免疫逃逸、增殖以及侵襲[17]。此外，鄭湘予等發(fā)現(xiàn)，CXCR4 siRNA能抑制人膀胱癌T24細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的形成[18]，但未檢測(cè)CXCR4基因沉默后對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。杜岳峰等構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動(dòng)子調(diào)控的CXCR4短發(fā)夾RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，并研究其對(duì)hTERT陽(yáng)性膀胱癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)的抑制效應(yīng)以及對(duì)細(xì)胞侵襲、增殖的影響，但只限于hTERT陽(yáng)性膀胱癌細(xì)胞[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后，T24細(xì)胞中的CXCR4蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)還促進(jìn)T24細(xì)胞的凋亡，抑制T24細(xì)胞的增殖，并顯著降低T24細(xì)胞的遷移能力，表明下調(diào)CXCR4基因可能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，沉默CXCR4基因可能是新的膀胱癌治療靶點(diǎn)。