酸敏感型自組裝苯硼酸治療系統(tǒng)的制備及體外抗腫瘤活性

唐 巖，李 淵，鄭翠霞，王 蕾，丁 波

(1.南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院普外科，河南 南陽(yáng) 473000；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

多西紫杉醇(docetaxel,DTX)是臨床上常用的化學(xué)治療藥物，DTX作為一種小分子藥物，由于半衰期短，缺乏腫瘤靶向性，限制了其在臨床中的應(yīng)用[1-2]。苯硼酸(phenylboronic acid,PBA)能夠與1,2-或1,3-二羥基化合物(如糖類、兒茶酚等)形成苯硼酸酯鍵[3-5]。唾液酸(sialic acid,SA)是分布在細(xì)胞膜表面糖基最末端的單糖，在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)[6-7]。含有PBA結(jié)構(gòu)的納米粒能夠與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的SA相結(jié)合，并通過(guò)受體介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。當(dāng)納米粒進(jìn)入細(xì)胞后，能夠快速釋放藥物，這對(duì)化學(xué)治療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用至關(guān)重要[3,8-9]。腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性藥物釋放已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于納米藥物遞送系統(tǒng)，且已達(dá)到增強(qiáng)療效、降低毒副作用的目的[10]。苯硼酸酯在中性或堿性環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中發(fā)生裂解，能夠?qū)δ[瘤部位的弱酸性環(huán)境產(chǎn)生快速響應(yīng)[11-12]。DTX/苯硼酸酯納米粒(phenylboronic acid-based self-assembly nanoparticles，PNPs)可以通過(guò)受體介導(dǎo)，增強(qiáng)其進(jìn)入細(xì)胞的能力，并快速響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境，從而達(dá)到高效遞送藥物、增強(qiáng)DTX抗腫瘤效果的目的。本研究將DTX裝載于共價(jià)自組裝PNPs中，制備DTX/PNPs系統(tǒng)，并探討其體外抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器人肝癌HepG2細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；DTX(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，對(duì)苯二胺和3、4-二羥基苯甲醛(阿拉丁生化科技股份有限公司)，4-甲?；脚鹚?山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)，泊洛沙姆188(德國(guó)BASF公司)；WSJB-03恒溫磁力攪拌器(河南中良科學(xué)儀器有限公司)，H1850R高速離心機(jī)(湖南湘儀科學(xué)儀器廠)，AB135-S型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Waters e2695 高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Nano-ZS 90型激光粒度分析儀(英國(guó)Marvin公司)，Mili-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純；緩沖溶液和樣品溶液配制用水均為超純水。

1.2 DTX/PNPs的制備

1.2.1 B，B′-[1,4-亞苯基雙(亞硝基甲基炔-1,4-亞苯基)]苯硼酸(Im-Ba)的合成合成路線見(jiàn)圖1。稱取50 mg對(duì)苯二胺、15 mg 4-甲?；脚鹚嶂糜趫A底燒瓶中，加入20 mL甲醇，得到黃色透明溶液。室溫?cái)嚢?，溶液逐漸由澄清變渾濁，12 h后結(jié)束反應(yīng)，12 000×g離心5 min，棄上清液；沉淀用冰甲醇洗滌3次，得到的黃色固體即為Im-Ba，真空干燥備用[13]。

1.2.2 4,4′-[1,4-亞苯基雙(亞甲氧基甲基)]1,2-苯二醇(Im-Ca)的合成合成路線見(jiàn)圖1。稱取150 mg對(duì)苯二胺、400 mg 3,4-二羥基苯甲醛溶于 10 mL 無(wú)水乙醇中，室溫、氬氣保護(hù)、避光條件下攪拌12 h。反應(yīng)結(jié)束后，12 000×g離心5 min，棄上清液；沉淀用預(yù)冷無(wú)水乙醇洗滌3次，得到的棕色固體即為Im-Ca，真空干燥備用[13]。

圖1 Im-Ba、Im-Ca的合成路線

Fig.1 Synthesis routes of Im-Ca and Im-Ba

1.2.3 DTX/PNPs的制備采用乳化溶劑揮發(fā)法制備DTX/PNPs。稱取10 mg Im-Ca和400 mg泊洛沙姆188置于15 mL EP管中，加入10 mL超純水，60 ℃水浴10 min使其溶解，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中。稱取10 mg Im-Ba和20 mg DTX置于 15 mL EP管中，加入10 mL甲醇，超聲使其溶解，然后在攪拌過(guò)程中滴加到Im-Ca和泊洛沙姆188水溶液中，室溫、避光、敞口攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在超純水中透析8 h以除去游離的DTX，所用透析袋截留相對(duì)分子量為8 000 000～14 000 000。

1.3 DTX/PNPs的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.3.1 制劑外觀取1.5 mL DTX/PNPs的水溶液于小玻璃瓶中，拍照觀察其外觀。

1.3.2 形態(tài)觀察取200 mg·L-1DTX/PNPs水溶液適量，滴加到銅網(wǎng)超薄碳膜上，自然晾干，用透射電鏡(TEM-1400)觀察其形態(tài)特征。

1.3.3 粒徑和電位表征配置200 mg·L-1DTX/PNPs水溶液適量，用Nano-ZS90型激光納米粒度儀測(cè)定其粒徑和Zeta電位。

1.3.4 穩(wěn)定性考察將DTX/PNPs稀釋至200 mg·L-1，室溫保存，每日測(cè)量其粒徑及電位，連續(xù)測(cè)量1周。

1.4 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定DTX含量

1.4.1 色譜條件色譜柱為Inertex C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇乙腈(3665，V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為(30±5) ℃，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)時(shí)間為12 min。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立精密稱取DTX對(duì)照品10 mg，用甲醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到濃度為200 mg·L-1的DTX儲(chǔ)備液，并依次稀釋成0.1、0.5、2.5、5.0、10.0、50.0 mg·L-1的系列濃度溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=10 384×C-4 404.9(R2=0.999 8)，線性范圍為0.10～50.00 mg·L-1。

1.4.3 載藥量測(cè)定將300 μL DTX/PNPs溶液分散到2.7 mL甲醇溶液中，并將該混懸液在冰浴條件下超聲處理30 min，確保DTX完全溶解于甲醇中，15 000×g離心10 min，按公式計(jì)算載藥率。載藥率=荷載的DTX量/(荷載的DTX量+所投PNPs量)×100%。

1.5 體外釋藥分別以pH值為5.0磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、pH值為6.0 PBS、pH值為7.4 PBS作為釋放介質(zhì)。取2 mL的DTX/PNPs溶液置于透析袋中，再向透析袋中加入 2 mL 透析介質(zhì)，透析袋兩端用繩子系緊，浸入30 mL釋放介質(zhì)中，置于搖床上，37 ℃恒溫，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1條件下釋藥。分別在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36 h時(shí)，取釋放介質(zhì)500 μL，再加入500 μL相應(yīng)空白釋放介質(zhì)。按照“1.4.1”項(xiàng)中的色譜條件檢測(cè)樣品，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中DTX濃度，并按照公式計(jì)算DTX的累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)，繪制釋放曲線。

1.6 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用人肝癌HepG2細(xì)胞[14]為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。將人肝癌HepG2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和含1%雙抗(100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液或傳代處理。

1.6.2 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測(cè)PNPs對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，接種于96孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為每孔7×103個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞貼滿孔底時(shí)，棄去原來(lái)的培養(yǎng)基，并加入含3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1PNPs的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。平行做2組，分別培養(yǎng)24、48 h后，加入1 mg·L-1MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置于搖床中,37 ℃ 100 r·min-1振搖 10 min；于 490 nm 處測(cè)量各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.6.3 MTT法檢測(cè)納米藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，接種于96孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為每孔7×103個(gè)，每孔加 100 μL 細(xì)胞懸液，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、DTX組、DTX/PNPs(pH值為6.0)組、DTX/PNPs(pH值為7.4)組。分別使用pH值為6.0、7.4的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋DTX/PNPs，使DTX濃度分別為0.135、0.270、0.800、2.500、5.000 mg·L-1。待細(xì)胞貼壁后，棄去原來(lái)的培養(yǎng)基，分別加入空白培養(yǎng)基、含DTX培養(yǎng)基、含DTX/PNPs(pH值為6.0)培養(yǎng)基和含DTX/PNPs(pH值為7.4)培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去含藥培養(yǎng)基，加入等體積的新鮮培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，按 “1.6.2”項(xiàng)下方法，使用MTT法檢測(cè)其在490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)納米藥物對(duì)細(xì)胞周期分布的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為每孔3×105個(gè)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組。待細(xì)胞貼壁后，棄去原來(lái)的培養(yǎng)基，PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組、空白對(duì)照組分別加入含PNPs(pH值為6.0)、DTX(pH值為6.0)、DTX/PNPs (pH值為6.0)和不含藥的新鮮培養(yǎng)基2 mL，其中DTX濃度為 3 mg·L-1，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇在4 ℃ 固定細(xì)胞24 h。棄去乙醇固定液，PBS洗滌2次，然后加入100 mg·L-1RNA酶作用30 min。棄去RNA酶溶液，用PBS洗滌2次，加入50 mg·L-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)500 μL，避光條件下作用30 min 后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。

1.6.5 PI染色法檢測(cè)納米藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為每孔3×105個(gè)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組。待細(xì)胞貼壁后，棄去原來(lái)的培養(yǎng)基，并分別加入含PNPs(pH值為6.0)、DTX(pH值為6.0)、DTX/PNPs (pH值為6.0)和不含藥的新鮮培養(yǎng)基2 mL，其中DTX濃度為3 mg·L-1，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。收集各組細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液；加入5 μL Binding Buffer和0.5 mL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素輕輕吹打重懸細(xì)胞，室溫避光作用30 min后，加入5 μL PI混勻，室溫避光作用 15 min 后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù) × 100%。

2 結(jié)果

2.1 DTX/BNPs納米粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1.1 DTX/PNPs的制備Im-Ba和Im-Ca的紅外光譜如圖2所示，3 409 cm-1和3 374 cm-1為對(duì)苯二胺中伯胺N-H的伸縮振動(dòng)峰，在合成的Im-Ba和Im-Ca中，叔胺無(wú)N-H，故無(wú)N-H伸縮振動(dòng)峰。4-甲酰基苯硼酸在2 844 cm-1和2 749 cm-1出現(xiàn)羰基C-H伸縮振動(dòng)峰，3、4-二羥基苯甲醛在2 872 cm-1和 2 766 cm-1出現(xiàn)羰基C-H伸縮振動(dòng)峰；二者在分別形成Im-Ba和Im-Ca后，羰基C-H伸縮振動(dòng)峰消失。證明成功制備前體化合物Im-Ba和Im-Ca。

A：Im-Ba;B:Im-Ca。

圖2 Im-Ba、Im-Ca的傅里葉紅外光譜圖

Fig.2 Fourier infrared spectroscopy of Im-Ba,Im-Ca

2.1.2 DTX/BNPs的外觀及粒徑電位結(jié)果見(jiàn)圖3。DTX/PNPs為球形，且在水溶液中穩(wěn)定，納米粒平均粒徑為(180.0±1.7) nm，多分散系數(shù)為0.18，電位為(-20.0±0.9) mV。

A：DTX/PNPs的透射電鏡圖；B：DTX/PNPs的外觀圖；C：DTX/PNPs的粒徑圖；D：DTX/PNPs的電位圖

圖3 DTX/PNPs的TEM、外觀、粒徑和電位圖

Fig.3 TEM image,appearance,size and zeta of DOX/PNPs

2.1.3 載藥量測(cè)定DTX的載藥量為(45.4±2.5)%。

2.1.4 穩(wěn)定性考察室溫條件下，DTX/PNPs在第1、2、3、5、7天的粒徑分別為(211.6±3.8)、(219.1±2.7)、(218.4±4.1)、(226.5±1.9)、(224.4±3.2) nm；電位分別為 (-21.7±1.1)、(-21.9±1.4)、(-22.0±1.2)、(-21.8±9.9)、(-22.1±1.6)mV。

2.2 DTX/BNPs體外釋藥結(jié)果見(jiàn)表1。在pH值為5.0、pH值為6.0、pH值為7.4的PBS溶液中，36 h時(shí)DTX累積釋放百分率分別為(80.61±3.09)%、(55.81±3.05)%、(11.88±1.90)%。DTX在pH值為5.0、pH值為6.0的PBS溶液中的累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)高于DTX在pH值為7.4的PBS溶液中的累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 DTX/PNPs體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

2.3.1 PNPs、DTX、DTX/PNPS對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果見(jiàn)表2和表3。培養(yǎng)24、48 h后，濃度為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1PNPs組的細(xì)胞存活率均大于90%。藥物作用48 h后，DTX濃度為0.135、0.270、0.800、2.500、5.000 mg·L-1時(shí)，DTX/PNPs(pH值為6.5)組、DTX/PNPs(pH值為7.4)組細(xì)胞抑制率高于DTX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；DTX/PNPs(pH值為6.5)組細(xì)胞抑制率高于DTX/PNPs(pH值為7.4)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 不同pH條件下DTX累積釋放百分?jǐn)?shù)比較

時(shí)間/hDTX累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)/%pH7.4pH6.0pH5.00.253.74±1.5115.46±2.4414.74±3.610.505.64±2.0920.61±2.5029.33±2.001.008.21±2.3029.62±2.1843.18±3.062.0010.61±2.6242.17±2.9057.81±4.324.0012.82±1.8950.10±3.49a75.77±2.64a8.0011.64±2.5052.72±2.95a78.86±3.36a12.0011.54±1.7854.78±3.40a80.99±4.27a24.0011.83±2.4655.00±3.27a79.02±3.11a36.0011.88±1.9055.81±3.05a80.61±3.09a

注：與pH值為7.4條件下比較aP<0.05。

表2 不同濃度PNPs作用后的細(xì)胞存活率

時(shí)間細(xì)胞存活率/%3.125mg·L-16.250mg·L-112.500mg·L-125.000mg·L-150.000mg·L-124h99.51±2.5198.66±2.4497.84±4.6195.67±3.8296.00±5.1148h98.92±3.9098.81±3.0597.98±2.9995.37±4.6195.89±3.72

表3 不同DTX濃度作用48 h空白對(duì)照組、DTX組、DTX/PNPs (pH值為6.5)組、DTX/PNPs (pH值為7.4)組細(xì)胞抑制率比較

組別細(xì)胞抑制率/%0.135mg·L-10.270mg·L-10.800mg·L-12.500mg·L-15.000mg·L-1空白對(duì)照組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00DTX組20.01±3.3235.54±2.4642.93±1.1853.59±1.9358.96±3.71DTX/PNPs(pH6.5)組52.44±3.58a64.16±2.65a72.81±2.29a80.73±2.14a89.06±1.52aDTX/PNPs(pH7.4)組39.29±3.97ab50.66±3.25ab57.15±2.92ab63.80±2.11ab73.36±1.67ab

注：與DTX組比較aP<0.001；與DTX/PNPs (pH 7.4)組比較bP<0.01。

2.3.2 各組細(xì)胞周期比較結(jié)果見(jiàn)表4。PNPs組G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞所占百分比與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DTX、DTX/PNPs組G0/G1期細(xì)胞所占百分比顯著低于空白對(duì)照組，S期細(xì)胞所占百分比顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3.3 PNPs、DTX、DTX/PNPs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡比較空白對(duì)照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(4.6±1.3)%、(4.6±1.7)%、(38.1±2.1)%和(44.2±1.9)%；空白對(duì)照組與PNPs組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DTX組、DTX/PNPs組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 空白對(duì)照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組細(xì)胞周期比較

組別細(xì)胞周期時(shí)相分布/%G0/G1期S期G2/M期空白對(duì)照組66.8±2.330.7±3.52.5±1.2PNPs組63.6±3.123.1±2.813.3±1.8DTX組41.7±1.2a48.7±2.9a9.5±2.3DTX/PNPs組26.3±1.9a59.6±2.3a14.1±4.2

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.01。

3 討論

癌癥是威脅人類生命健康的重大疾病，發(fā)病率和病死率逐年上升。目前臨床上癌癥的治療方法主要有化學(xué)治療、放射治療、手術(shù)治療等，其中化學(xué)治療是臨床上最常用的治療手段或者輔助治療的手段。小分子化學(xué)治療藥物DTX由于其選擇性較差，所以毒副作用較強(qiáng)。為了改善化學(xué)治療藥物的毒副作用，將納米技術(shù)應(yīng)用于抗腫瘤藥物的遞送，不僅能降低藥物的毒副作用，還能夠有效克服藥物遞送屏障，提高腫瘤治療效果。本研究利用苯硼酸酯能夠響應(yīng)腫瘤微環(huán)境弱酸性的特點(diǎn)，以苯硼酸兒茶酚酯鍵為連接鍵，以泊洛沙姆188為穩(wěn)定劑，以DTX為化學(xué)治療藥物模型，成功構(gòu)建具有細(xì)胞識(shí)別作用和腫瘤微環(huán)境響應(yīng)特性的共價(jià)自組裝納米粒。本研究所制備的DTX/PNPs pH雙響應(yīng)行為可描述為：在腫瘤弱酸性的微環(huán)境中，納米粒表面的泊洛沙姆層脫落，納米粒結(jié)構(gòu)改變，暴露出能與SA結(jié)合的PBA；通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，納米粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，由于腫瘤內(nèi)部酸性環(huán)境更強(qiáng)，酯鍵快速斷裂，納米粒分崩離析，實(shí)現(xiàn)酸響應(yīng)性藥物快速釋放[15-17]。

本研究首先對(duì)DTX/PNPs的性質(zhì)進(jìn)行了考察。納米粒的形貌及粒徑、電位等參數(shù)是評(píng)價(jià)納米粒質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，利用透射電鏡對(duì)納米粒的形貌進(jìn)行了考察，利用動(dòng)態(tài)光散射對(duì)DTX/PNPs的粒徑分布和電位大小進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DTX/BNPs納米粒分散性好，粒形態(tài)均一，而且其粒徑大小符合腫瘤深層滲透的條件。1周內(nèi)納米粒的電位和粒徑變化結(jié)果表明，泊洛沙姆188的存在能夠有效的維持了納米粒的穩(wěn)定性。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，DTX/PNPs的酸敏感性良好，酸性環(huán)境能夠有效地促進(jìn)苯硼酸酯鍵的斷裂，進(jìn)而納米粒崩解，實(shí)現(xiàn)定位釋藥。

本研究選取人肝癌HepG2細(xì)胞為模型[14,18]，對(duì)DTX/PNPs的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了考察。PNPs濃度為50 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)48 h細(xì)胞存活率仍大于90%，說(shuō)明PNPs安全性高，分析原因?yàn)榻M成PNPs納米粒的單體化合物安全無(wú)毒，而且泊洛沙姆188的生物相容性好[15,19]。DTX/PNPs在弱酸性環(huán)境中能增強(qiáng)SA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，且在腫瘤內(nèi)部快速釋放藥物[20-21]，DTX、DTX/PNPs作用48 h后對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制均表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。DTX/PNPs對(duì)細(xì)胞抑制作用要高于DTX，主要是因?yàn)樵趐H值為6.0的弱酸性環(huán)境中，DTX/PNPs表面的泊洛沙姆脫落，PBA暴露，SA介導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞[16-17]。為進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)理論，對(duì)DTX/PNPs在不同pH環(huán)境中對(duì)細(xì)胞的抑制情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，DTX/PNPs在pH值為6.0的環(huán)境中對(duì)腫瘤的抑制效果強(qiáng)于pH值為7.4的環(huán)境中對(duì)細(xì)胞的抑制效果。利用化學(xué)治療方法治療腫瘤的機(jī)制之一就是對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA造成損傷[22-23]?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞主要分布于G0/G1期,與空白對(duì)照組相比，PNPs組細(xì)胞周期時(shí)相分布無(wú)明顯變化，說(shuō)明載體生物相容性好，無(wú)明顯毒副作用。DTX和DTX/PNPs明顯阻滯細(xì)胞周期于S和G2/M期。并且，與空白對(duì)照組比較，DTX/PNPs組G0/G1期細(xì)胞所占百分比減少，提示DTX/PNPs阻滯作用更明顯。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，相對(duì)于空白對(duì)照組、DTX組、DTX/PNPs組可誘導(dǎo)更多的細(xì)胞發(fā)生凋亡。DTX/PNPs能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要是因?yàn)榧{米粒能夠特異性響應(yīng)腫瘤酸性環(huán)境，定點(diǎn)釋藥，此外，也與脫落的泊洛沙姆188抑制了p-糖蛋白對(duì)藥物的外排密切相關(guān)[22]，綜上所述，DTX/PNPs納米粒的制備比較簡(jiǎn)單，靶向性強(qiáng)，生物相容性好，安全性高，能夠提高藥物的生物利用度，為實(shí)現(xiàn)腫瘤高效治療提供了新途徑。