臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性卵巢缺血再灌注損傷小鼠卵巢組織中過氧化物歧化酶及白細(xì)胞介素-12表達(dá)的影響

鄒曉萍，葉豪奕，程 虎，回月彤，商崇智，董化江，王 磊，徐 健

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科,天津 300162；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津 300189；3.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科，天津 300161；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

卵巢扭轉(zhuǎn)為女性常見急癥，多由于劇烈運(yùn)動(dòng)后及腫瘤壓迫、腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊、嵌頓疝時(shí)腸系膜靜脈和動(dòng)脈受壓等所致，如處理不及時(shí)可出現(xiàn)卵巢梗死或卵巢破裂，恢復(fù)血液供應(yīng)是最為有效的治療方法[1-2]。發(fā)生扭轉(zhuǎn)的卵巢恢復(fù)正常解剖位置后血液供應(yīng)得到恢復(fù)，卵巢組織損傷反而較單純?nèi)毖A段更為嚴(yán)重，即出現(xiàn)卵巢組織缺血再灌注損傷，其多由免疫微環(huán)境紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自由基增多等因素引起，臨床上尚無特效藥物和效果好的處理手段[3-5]。近年來，部分干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于臨床，取得了較好的治療效果[6-8]。間充質(zhì)干細(xì)胞(matrix stem cells,MSC)在免疫系統(tǒng)疾病及組織再生領(lǐng)域不斷顯示出其優(yōu)勢(shì)，其治療效用的維持依賴于細(xì)胞替代及“偽旁觀者效應(yīng)”2種機(jī)制[9]。本研究選用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-matrix stem cell,UC-MSC)對(duì)卵巢扭轉(zhuǎn)小鼠進(jìn)行干預(yù)治療,探討其對(duì)缺血再灌注損傷卵巢炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷的影響，為卵巢缺血再灌注損傷提供新的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組無特定病原體級(jí)C57BL/6NCrl雌性小鼠30只，體質(zhì)量18～23 g，購自華阜康生物科技股份有限公司(北京)，品系編碼：213。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和干細(xì)胞組，每組10只。各組小鼠于18.5～21.5 ℃、濕度38.8%～43.5%環(huán)境分籠喂養(yǎng)，給予充足的潔凈飲水和食物，每日日光燈照射時(shí)間為12 h。

1.2 主要試劑與儀器UltraCULYURETM培養(yǎng)基(美國(guó)Lonza公司)，白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清、過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)多克隆抗體(美國(guó)Gibco公司)，CD90、CD73、CD105流式抗體(美國(guó)BD公司)，RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)儀(美國(guó)MJ Research公司)，Western blotting 電泳儀、Western blotting電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)，CX23生物顯微鏡(日本Olympus公司)，生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 UC-MSC分離與擴(kuò)增臍帶來源于本院產(chǎn)婦，均經(jīng)產(chǎn)婦本人及家屬知情同意,并簽訂相關(guān)的醫(yī)療文書及臍帶使用知情同意書。將潔凈臍帶去除血液和表皮組織，剝離臍帶內(nèi)的2條動(dòng)脈及1條靜脈，剩余組織為華通膠，將華通膠剪切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，第7天可見有UC-MSC自華通膠內(nèi)爬出，第10天細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部，按照1傳5的比例進(jìn)行傳代擴(kuò)增，然后按照1傳2的比例進(jìn)行擴(kuò)增，選取第3代細(xì)胞用于本研究。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為CD73、CD90、CD105陽性細(xì)胞數(shù)>95%，CD34陽性細(xì)胞數(shù)<3%，細(xì)胞活力 ≥95%，病原菌排查未檢出細(xì)菌。

1.4 小鼠卵巢缺血再灌注模型制備及各組干預(yù)措施各組小鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，給予100 g·L-1水合氯醛(0.004 mL·g-1)麻醉，切開下腹部皮膚、肌肉，暴露卵巢組織；其中假手術(shù)組小鼠僅在卵巢動(dòng)脈下穿線，不阻斷卵巢動(dòng)脈的血流供應(yīng)；模型組與干細(xì)胞組小鼠阻斷卵巢動(dòng)脈血液供應(yīng)30 min，而后剪斷卵巢動(dòng)脈的結(jié)扎線，恢復(fù)卵巢血液供應(yīng)。干細(xì)胞組小鼠于恢復(fù)卵巢血液供應(yīng)后24 h后經(jīng)尾靜脈注射1.0×106個(gè)UC-MSC，假手術(shù)組、模型組小鼠均于同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射相同體積的生理鹽水；各組小鼠均于尾靜脈注射72 h后采用安樂死方法處死，取手術(shù)側(cè)卵巢組織標(biāo)本待檢。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組小鼠卵巢組織中IL-12和SOD mRNA表達(dá)應(yīng)用TRIzol試劑提取各組小鼠手術(shù)側(cè)卵巢組織總RNA，根據(jù)試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。IL-12引物序列：上游引物序列為5′-TTTCTAGATGCTGGCCAATACA-3′,下游引物序列為5′-ATCTCGGTGGACCAAATTCC-3′。SOD引物序列：上游引物序列為5′-AGCGTGACTTTGGGTCTTT-3′,下游引物序列為5′-GCGACCTTGCTCCTTATTG-3′。β-actin引物序列：上游引物序列為5′-GTGTGGATTGGTGGCTCTATC-3′,下游引物序列為5′-CAGTCCGCCTAGAAGCATTT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min，變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用快速凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜條帶，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.6 Western blot法檢測(cè)各組小鼠卵巢組織中IL-12和SOD蛋白表達(dá)取各組小鼠手術(shù)側(cè)卵巢組織100 mg，加入1 mL蛋白磷酸酶細(xì)胞裂解液(4 g·L-1)，液氮研磨，4 ℃、12 000 r·min-1、離心半徑15 cm條件下離心20 min。取總蛋白樣本 50 μg，分離膠進(jìn)線分離總蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，封閉5 h，加入一抗(IL-12多克隆抗體或SOD多克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，曝光、掃描底片，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，對(duì)各組目的基因條帶的灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，灰度值越高，表示蛋白表達(dá)量越大。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD mRNA表達(dá)比較結(jié)果見表1。3組小鼠卵巢組織中IL-12、SOD mRNA表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.761、3.134，P<0.01)。模型組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干細(xì)胞組與假手術(shù)組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD mRNA表達(dá)比較

組別nIL-12mRNASODmRNA假手術(shù)組100.194±0.0410.258±0.109模型組100.568±0.186a0.290±0.131a干細(xì)胞組100.309±0.163b0.741±0.228abF3.7613.134P<0.01<0.01

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.2 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD蛋白表達(dá)比較結(jié)果見表2、圖1。3組小鼠卵巢組織中IL-12、SOD蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.520、4.458，P<0.01)。模型組小鼠卵巢組織中IL-12蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中IL-12蛋白表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干細(xì)胞組與假手術(shù)組小鼠卵巢組織中IL-12蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中SOD蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中SOD蛋白表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD蛋白表達(dá)比較

組別nIL-12蛋白SOD蛋白假手術(shù)組100.231±0.1010.194±0.089模型組100.649±0.214a0.224±0.091a干細(xì)胞組100.254±0.070b0.579±0.243abF2.5204.458P<0.01<0.01

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：干細(xì)胞組。

圖1 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD蛋白表達(dá)(Western blot)

Fig.1 Expression of IL-12 and SOD protein in ovarian tissues of mice in the three groups(Western blot)

3 討論

卵巢扭轉(zhuǎn)是女性常見病，可見于劇烈運(yùn)動(dòng)后及血管外腫瘤壓迫、腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊、嵌頓疝時(shí)腸系膜靜脈和動(dòng)脈受壓等情況下，如果處理不當(dāng)，輕者可出現(xiàn)輸卵管粘連、阻塞，重者可出現(xiàn)卵巢梗死、破裂等[1-3]?；謴?fù)血流灌注是該病的有效治療方法，但在扭轉(zhuǎn)的卵巢恢復(fù)正常解剖部位及血液供應(yīng)后，往往卵巢組織損傷較缺血階段更為嚴(yán)重，相繼出現(xiàn)各類并發(fā)癥，臨床處理棘手，治療效果差，因此，對(duì)卵巢扭轉(zhuǎn)的處理仍需高度重視[3-5]。

MSC是一類具有體外擴(kuò)增和多向分化潛能的細(xì)胞，可分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[6-8]。研究表明，不同組織來源的MSC及其分泌的細(xì)胞因子和外泌體可通過改善卵巢組織微環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)而促進(jìn)卵泡發(fā)育，恢復(fù)卵巢早衰患者的卵巢功能及生育能力[9]。另有研究證實(shí)，UC-MSC及骨髓來源的MSC外泌體可通過調(diào)節(jié)血清激素水平，降低順鉑對(duì)卵巢的損傷，修復(fù)卵巢功能[10]。在體外培養(yǎng)的UC-MSC可通過旁分泌或自分泌方式產(chǎn)生多種具有生物活性的因子，如缺血誘導(dǎo)的因子、神經(jīng)源性生長(zhǎng)因子、血管生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)起源的因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，對(duì)損傷組織的恢復(fù)及組織重建具有促進(jìn)作用[8]。UC-MSC在抑制炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程中具有雙重作用，可通過抑制炎癥進(jìn)程及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用而抑制炎癥反應(yīng)，維持機(jī)體免疫微環(huán)境穩(wěn)定[8,11-12]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，使用UC-MSC培養(yǎng)上清液提取物進(jìn)行治療亦可起到與細(xì)胞治療類似的效果，UC-MSC的治療作用機(jī)制涵蓋細(xì)胞替代作用及 “無細(xì)胞”的“偽旁觀者效應(yīng)”2種途徑[9,13-14]。

IL-12作為促進(jìn)炎癥反應(yīng)的重要炎性因子，在炎癥進(jìn)程中的作用不可輕視，阻斷IL-12的炎癥反應(yīng)通路對(duì)有效控制炎癥有重要意義。缺氧或局部缺血情況下可引發(fā)活性氧(reactive oxygen specie，ROS)大量產(chǎn)生，過多的ROS可直接損傷細(xì)胞膜、DNA和蛋白質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變和喪失，并抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[13-17]。樊志剛等[13]研究證實(shí)，胚胎干細(xì)胞可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)程而逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。袁春菊[17]研究顯示，依那普利對(duì)梗死心肌微環(huán)境的調(diào)節(jié)有助于提高UC-MSC的療效，其主要作用機(jī)制為抑制炎癥級(jí)聯(lián)放大及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，而這二者對(duì)損傷心室的重構(gòu)具有促進(jìn)作用?；谏鲜鲅芯?本課題組推測(cè)UC-MSC可通過抑制炎癥反應(yīng)及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護(hù)受損卵巢組織。臍帶作為醫(yī)療廢品,重新再利用可實(shí)現(xiàn)“變廢為寶”；同時(shí)，UC-MSC體外擴(kuò)增及分化能力強(qiáng),是良好的“種子細(xì)胞”[6,8,15]?；谏鲜鲈?，本研究選用無倫理學(xué)爭(zhēng)議的UC-MSC，觀察其對(duì)炎癥因子IL-12及氧化應(yīng)激損傷的代表性酶SOD的影響，以探討其對(duì)卵巢扭轉(zhuǎn)小鼠的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA、IL-12蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組；而經(jīng)過UC-MSC干預(yù)后，干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA、IL-12蛋白表達(dá)顯著低于模型組，且干細(xì)胞組與假手術(shù)組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA、IL-12蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示UC-MSC干預(yù)可有效下調(diào)卵巢缺血再灌注小鼠卵巢組織中IL-12表達(dá)，因此，UC-MSC可作為卵巢扭轉(zhuǎn)后控制炎癥反應(yīng)的重要干預(yù)手段之一。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA、SOD蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，且干細(xì)胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA、SOD蛋白表達(dá)高于模型組；提示卵巢缺血再灌注損傷小鼠卵巢組織中SOD表達(dá)有所上調(diào)，UC-MSC干預(yù)可進(jìn)一步上調(diào)SOD表達(dá)，從而有效減輕小鼠缺血再灌注損傷卵巢組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化損傷。

綜上所述，UC-MSC移植可降低小鼠缺血再灌注損傷卵巢組織中IL-12表達(dá)，提高SOD表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激損傷，有益于受損卵巢功能的恢復(fù)。本研究為卵巢缺血再灌注損傷的干細(xì)胞治療提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)，但不足之處在于尚不能明確其分子機(jī)制及UC-MSC的作用機(jī)制，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。