新疆不同棉花品種（系）對土耳其斯坦葉螨抗性的鑒定及其葉片表面蠟質(zhì)分析

劉凱揚(yáng)，王有武，趙倩，王春娟，趙伊英*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子8320002；2.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

新疆是我國棉花主產(chǎn)區(qū)，而蟲害每年對新疆棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。土耳其斯坦葉螨（Tetranychus turkestani）是北疆棉田害螨優(yōu)勢種群[1]，一般在棉花葉片背面活動，對棉花的葉片、嫩枝、嫩莖、花萼、果柄及幼嫩的蕾鈴部位進(jìn)行危害。該蟲的危害方式以刺吸為主，吸食細(xì)胞液和葉綠粒，影響植物光合作用，葉正面初始出現(xiàn)紅白色斑點，后逐漸變紅，最后葉片皺縮干枯掉落[2]。目前對棉花害螨田間防治，以化學(xué)防治為主。持續(xù)大劑量地噴施農(nóng)藥，不僅使棉葉螨的抗藥性增強(qiáng)，還殺死大量天敵，導(dǎo)致棉葉螨的抗性增長，防治更加困難，造成的損害也有逐年增長的趨勢[3]。因此，篩選抗蟲棉花種質(zhì)，并對其抗性機(jī)制進(jìn)行深入研究，是持續(xù)控制害蟲的有效途徑。

植物表皮蠟質(zhì)會影響植食性昆蟲對寄主植物的選擇、取食和產(chǎn)卵[4]。近年來，在植物的組織結(jié)構(gòu)如葉片茸毛等，與抗蟲相關(guān)性有較多的研究報道[5]；在單寧、棉酚以及黃酮等棉花次生代謝物質(zhì)與棉葉螨抗性的相關(guān)性方面也有報道[6]。但截至目前，陸地棉（Gossypium hirsutum）抗螨品種培育還沒有大的突破。因此，本研究對新疆有代表性的236個棉花材料進(jìn)行抗螨性鑒定，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析棉花葉片蠟質(zhì)組分，并對棉花蠟質(zhì)含量及組分與抗螨性進(jìn)行相關(guān)性分析，將為棉花抗螨品種選育及棉葉螨防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉品種及種質(zhì)236個，包括：北疆主要的新陸早系列品種如新陸早35號等；南疆主要的新陸中系列品種如新陸中1號、新陸中6號、新陸中33號等；新疆常見棉花種植品種（系）X-4、X-46等；轉(zhuǎn)精氨酸激酶基因（AK）與幾丁質(zhì)酶基因（CHI）抗螨棉花品系A(chǔ)CH156及其轉(zhuǎn)基因受體材料YZ-1。所有品種（系）均由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室提供。

土耳其斯坦葉螨（T.turkestaniUgarov et Nikolski）為引自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲生態(tài)實驗室的敏感品系，在實驗室內(nèi)用盆栽豇豆苗葉片進(jìn)行繁殖，置于（26±1）℃、相對濕度為 65%的人工氣候箱（光/暗時間（光周期）為16 h/8 h）內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 螨害鑒定與分級標(biāo)準(zhǔn)

棉花材料螨害的室內(nèi)鑒定主要參照杜雄明等的方法[7]：先在室外進(jìn)行營養(yǎng)缽育苗，每份材料播10缽，每缽播種3粒，出苗后每缽保留2株生長基本一致的健壯棉苗。待棉苗到3葉期時，清除棉苗上所有的害蟲和天敵，移入溫度為28℃、相對濕度為65%、光/暗時間為16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培育。然后用毛筆尖將棉葉螨接到棉苗頂尖上，每株接成螨5頭，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育。接螨2周后開始螨害調(diào)查。參照杜雄明等的方法，對棉花葉片受螨害程度進(jìn)行分級[7]。葉片受螨害程度分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，真葉未受害，生長正常；1級，真葉表面出現(xiàn)黃白色小斑，斑面積小，占全葉l/3以下；2級，全真葉l/3～l/2面積出現(xiàn)紅斑；3級，全真葉l/2～2/3面積出現(xiàn)紅斑；4級，全真葉2/3以上面積出現(xiàn)紅斑，未完全脫落；5級，真葉即將脫落或完全脫落[7]。并按下式計算葉片受害級數(shù)：葉片受害級數(shù)＝∑（受害級別×相應(yīng)受害級別的葉片數(shù)）/調(diào)查總?cè)~片數(shù)。以葉片受害級數(shù)評價其抗性，抗棉葉螨分級標(biāo)準(zhǔn)：高抗（High resistance，HR）， 葉片受害級數(shù)＜1.0；抗（Resistance，R），葉片受害級數(shù)在[1.0，2.5)；中抗（Moderate resistance，MR）， 葉 片 受 害 級 數(shù) 在[2.5～3.5)；感（Susceptibility，S），葉片受害級數(shù)在[3.5～4.5)；高感（High susceptibility，HS），葉片受害級數(shù)≥4.5。

1.3 真葉表面蠟質(zhì)含量的測定與蠟質(zhì)組分分析

棉花葉片表面蠟質(zhì)含量的測定：取洗干凈的培養(yǎng)皿稱量（m0），將預(yù)熱60℃的氯仿倒入培養(yǎng)皿中。將不同品種（系）的陸地棉種質(zhì)資源培養(yǎng)至3片真葉期，每個品種（系）選取3株長勢相當(dāng)?shù)慕衙廾纾∑溟L出的第1片真葉并用2 cm×2 cm的打孔器打孔，將所得的棉花葉片稱量（m1）后放入培養(yǎng)皿中1 min，用氮吹儀使氯仿?lián)]發(fā)后，再稱得培養(yǎng)皿質(zhì)量（m2）。棉花品種（系）真葉表面蠟質(zhì)含量CW＝（m2－m0）/m1（單位：mg·g－1）。

棉花葉片表面蠟質(zhì)組分分析主要參照J(rèn)etter等方法[8]進(jìn)行。采用GC-MSQP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津公司，日本）對各品種（系）真葉表面蠟質(zhì)成分進(jìn)行分析：載氣為氦氣，采用DB-1石英毛細(xì)管柱（長度×內(nèi)徑×膜厚＝30.0 m×0.32 mm×0.10 μm）分析棉花真葉脂肪酸甲酯組分；升溫程序50.0℃保持2 min，以40℃·min－1升至 200℃， 保持 2 min；3℃·min－1升至 320℃，保持30 min；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣方式：分流，分流比10.0；初始壓力500～900 kPa；流量控制方式：線速度；壓力：176.6 kPa；線速度20.0 cm·s－1。

2 結(jié)果與分析

2.1 土耳其斯坦葉螨對棉花不同品種（系）的螨害調(diào)查

236個棉花品種（系）對棉葉螨的抗性分級結(jié)果表明：大部分的棉花品種（系）對土耳其斯坦葉螨的危害表現(xiàn)敏感，不同抗性的品種（系）間受害等級存在顯著差異。其中：高抗（HR）的品系有2個，分別為ACH56與XS13，葉片受害級數(shù)分別為 0.87和 0.89（表 1）；表現(xiàn)出較明顯抗性（R）的品種（系）有X-4、新陸中 6號和 X-46，葉片受害級數(shù)在1.44～2.39；有22個品種（系）表現(xiàn)為中抗（MR）；敏感（S）的材料有 207 份；高感（HS）品種（系）有新陸中34和16B-3，葉片受害級數(shù)在4.55左右。

表1 部分參試棉花品種（系）對棉葉螨的抗性Table 1 Resistance of partial cotton varieties(lines)in Xinjiang to T.turkestani

2.2 各品種真葉表面蠟質(zhì)含量測定

對表 1 中列出的高抗螨（HR）、抗螨（R）、中抗螨（MR）、感螨（S）及高感螨（HS）材料的棉葉蠟質(zhì)含量測定結(jié)果表明，高抗螨、抗螨與高感棉花品種（系）的蠟質(zhì)含量存在顯著差異。XS13、X-4與新陸中6號真葉的蠟質(zhì)含量較高，而新陸中34號與16B-3等真葉蠟質(zhì)含量相對較低?？傮w來說，抗螨品種（系）的棉葉蠟質(zhì)含量明顯高于感螨品種（系）。其中：高抗品系XS13真葉的蠟質(zhì)含量達(dá)到了3.09 mg·g－1，比含量最低的高感品系16B-3的含量多近1倍；X-4、新陸中6號、X-46比全棉3號分別高54.02%、33.91%、32.18%。需要說明的是，轉(zhuǎn)基因抗螨材料ACH56的葉片蠟質(zhì)含量僅為 1.89 mg·g－1，與其對照 YZ-1 相比沒有明顯變化，但是其受害級別遠(yuǎn)低于YZ-1，接近高抗葉螨棉花品種XS13，推測ACH56通過表達(dá)抗螨基因，殺死了部分葉螨，達(dá)到較好的抗螨效果。Pearson相關(guān)性分析表明，棉葉表面蠟質(zhì)含量與葉片受害級數(shù)存在顯著的負(fù)相關(guān)（r＝－0.936，P＜0.05），即棉葉蠟質(zhì)含量越高，其葉片受害級數(shù)越低（圖 1）。

2.3 高抗與高感棉花真葉表面蠟質(zhì)成分測定

對高抗品系XS13與高感品系16B-3葉片蠟質(zhì)的GC-MS分析結(jié)果（圖2）表明，棉花葉片表皮蠟質(zhì)主要成分為烷烴類化合物，同時含有少量的酯類、醚類、脂肪酸等化合物。其中：飽和烷烴16種，包括 10種長鏈單鏈烷烴[C17烷（C17H36）、C19烷（C19H40）、C20烷（C20H42）、C21烷（C21H44）、C24烷（C24H5O）、C31烷（C31H64）、C33烷（C33H68）、C35烷（C35H72）、C43烷（C43H88）、C44烷（C44O90）]，4 種長鏈支 鏈 烷 烴[C25烷（C25H52）、C27烷（C27H56）、C29烷（C29H60）、C50烷（C50H102）]，鹵代烷（C54H108Br2）和稠環(huán) 芳 烴（C26H48）； 另 有 不 飽 和 脂 類 化 合 物（C23H44O3）、 鹵代酯（C36H65F7O2）、 醚類化合物（C37H76O）與長鏈飽和脂肪酸（C69H138O2）各 1種。

圖1 不同棉花品種（系）葉片表面蠟質(zhì)含量及其抗螨性Fig.1 Surface wax content of leaves and mite resistance of different cotton varieties(lines)

圖2 高抗及高感棉葉螨棉花品系蠟質(zhì)成分分析Fig.2 Analysis of wax components in cotton high resistant line and high sensitive line to T.turkestani

在高抗品系XS13的葉片蠟質(zhì)組分中，烷烴類化合物、酯類化合物、醚類化合物和脂肪酸的峰面積占比（相對含量）分別為87.35%、9.44%、2.92%和0.29%，化合物平均峰面積占比為5%，其中高于平均峰面積占比的化合物有11種，包括烷烴類化合物 10種 [C27H56（7.47%）、C26H48（6.90%）、C25H52（6.88%）、C29H60（6.74%）、C24H50（6.67%）、C33H68（6.67%）、C31H64（6.58%）、C20H42（6.21%）、C21H44（6.14%）、C19H40（5.45%）]和酯類化合物 1 種 C23H44O3（7.46%）。

高感品系中，烷烴類化合物、酯類化合物、醚類化合物和脂肪酸分別占85.59%、9.00%、3.59%和1.82%，化合物平均峰面積占比為5%，其中高于平均峰面積占比的化合物有12種，包括烷烴類化合物 11 種[C29H60（7.38%）、C26H48（6.91%）、C27H56（6.76% ）、C25H52（6.64% ）、C31H64（6.49% ）、C33H68（6.27% ）、C20H42（6.24% ）、C21H44（6.24% ）、C35H72（6.20%）、C19H40（5.57%）、C17H36（5.15%）]和酯類化合物1種C23H44O3（6.78%）。

在高抗螨品系XS13的葉片蠟質(zhì)組分中，烷烴類物質(zhì) C27H56、C25H52、C33H68、C31H64、C24H50的相對含量高于高感品系16B-3，其中C24H50在2個品種中含量差距最大（在16B-3中含量僅為2.51% ）；XS13 中 C26H48、C29H60、C20H42、C21H44、C35H72、C17H36的相對含量低于高感品系 16B-3，其中 C35H72、C17H36的分別為 4.89%、4.93%，低于平均峰面積占比，且在2個品種中含量差距較大；XS13中酯類物質(zhì)C23H44O3相對含量高于16B-3。

3 討論

棉花是我國支柱性產(chǎn)業(yè)，新疆又是國內(nèi)最大的棉花產(chǎn)區(qū)，其地理位置氣候條件是棉花種植的理想地區(qū)，同時因為氣候在夏季高溫干旱，也是棉葉螨適應(yīng)區(qū)。近年來，新疆棉區(qū)棉葉螨呈偏重發(fā)生態(tài)勢，危害嚴(yán)重可造成棉田減產(chǎn)30%以上[9]。過度依賴化學(xué)藥劑防治害螨，不但殺死了大量天敵，而且還增強(qiáng)了害螨的抗藥性。張金發(fā)等研究表明，海島棉和二倍體栽培棉的中棉和草棉，對朱砂葉螨具有較高水平的抗性[10]。王朝生等鑒定了3種不同遺傳類型（海島棉、陸地棉、海陸雜交棉）的棉花種質(zhì)材料對棉葉螨的抗性，結(jié)果表明，海島棉受棉葉螨為害最輕，而陸地棉受害最重[11]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)栽培的棉花主要是四倍體的陸地棉。目前，在陸地棉抗螨品種培育上，還沒有大的突破。

棉花在長期與植食性螨類的選擇進(jìn)化下，會產(chǎn)生一些防御手段，包括棉花形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)的抗螨性如葉片茸毛量、葉形、蠟質(zhì)含量、生長速度等[12]，生理生化抗螨性如含水量、氨基酸含量及組分、單寧含量、棉酚含量、可溶性糖含量等。不同的抗螨品種或材料具有不盡相同的抗螨機(jī)制。因此，在抗螨育種中，應(yīng)盡量選擇具有上述多種抗螨機(jī)制的材料加以利用。

表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面最外層的保護(hù)物質(zhì)[13]，表皮蠟質(zhì)具有阻止植物非氣孔性散失、防治有害光線損傷、維持表面清潔與表面防水、避免被細(xì)菌和昆蟲侵害的功能。已有大量研究報道植物蠟質(zhì)在植物抗逆境脅迫中發(fā)揮者重要作用。蠟質(zhì)主要由烷烴、酯類、游離脂肪醇和酸等多種化合物組成，在昆蟲與寄主植物互作和協(xié)同進(jìn)化過程中扮演著重要的角色[14]。植物葉片表面蠟質(zhì)提取物和單一的蠟質(zhì)成分能夠刺激或者抑制植食性昆蟲對寄主植物的選擇、取食和產(chǎn)卵[15-18]。Daoust等研究發(fā)現(xiàn)[15]，ɑ-松菇和月桂烯在抗云杉食心蟲白云杉（Picea glauca）針葉中的含量是其在敏感型中含量的3～5倍，證實單松烯類在云杉抗食心蟲侵蝕中發(fā)揮重要作用。Eigenbrode等[16]報道了抗蟲和感蟲甘藍(lán)品種葉片表面蠟質(zhì)對小菜蛾（Plutella xyllostella）選擇行為的影響；劉勇等[17]研究了不同小麥品種（系）葉片表面蠟質(zhì)對2種麥蚜取食的影響。本研究表明，棉花葉片蠟質(zhì)成分多數(shù)為烷烴類化合物，少數(shù)為酯類、醚類、脂肪酸等化合物。高抗螨品系中棉花葉片蠟質(zhì)成分烷烴類和酯類組分的含量高于高感品系，醚類化合物和脂肪酸相對含量總和低于高感品系。上述結(jié)果對通過育種和栽培手段調(diào)控植物以提高植物抗逆性有重要意義[18]。

4 結(jié)論

對236份棉花材料的鑒定結(jié)果表明：近90%的材料對棉葉螨的危害表現(xiàn)敏感；不同棉花品種（系）真葉的蠟質(zhì)含量存在明顯差異。棉葉表面蠟質(zhì)含量與葉片受害級數(shù)存在顯著的負(fù)相關(guān)。高感和高抗螨品系的葉片蠟質(zhì)最主要組分均為烷烴類，少數(shù)為酯類、醚類、脂肪酸等化合物。高抗螨品系葉片中烷烴類和酯類化合物含量要高于高感螨品系，而醚類和脂肪酸化合物組分含量要低于高感螨品系； 烷烴類化合物 C24H50、C35H72、C17H36在抗螨、感螨棉花材料中的含量差異較大。這些蠟質(zhì)組分含量的差異是否導(dǎo)致棉花對螨抗性的差異，仍有待于進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步探究棉花葉表蠟質(zhì)組分對棉葉螨寄主選擇和抗螨作用的影響奠定了基礎(chǔ)。