水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物檢測方法對比研究

吳亞梅　符云　李緒鵬

摘 要 ：本文對水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物兩種檢測方法進行對比研究。就農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006（簡稱方法1）和GB/T 20752-2006（簡稱方法2）兩種檢測方法的線性、檢出限、精密度、回收率等方面進行對比試驗。結(jié)果表明，兩種方法AOZ、AHD、AMOZ、SEM在0.5ng/mL-10.00ng/mL同一濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，方法1檢出限分別為0.010?g/kg、0.014?g/kg、0.021?g/kg、0.017?g/kg，精密度分別為0.67%、0.97%、1.36%、1.12%，平均回收率分別為98.3%、101.7%、96.1%、100.7%;方法2檢出限分別為0.035?g/kg、0.10?g/kg、0.058?g/kg、0.054?g/kg，精密度分別為2.35%、7.97%、4.14%、3.65%，平均回收率分別為95.3%、87.7%、87.9%、87.7%。結(jié)論，方法1前處理方法簡單，檢測信號干擾少，檢出限、精密度和回收率優(yōu)于方法2，結(jié)果相對更準確可靠，更適用于測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的含量。

關(guān)鍵詞：液相-串聯(lián)質(zhì)譜;水產(chǎn)品;硝基呋喃

1? 引言

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素[1]，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用。它們作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用。硝基呋喃類藥物曾廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，以治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎病、疥瘡病、赤鰭病、潰瘍病等。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎副作用，我國于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令[2]。

硝基呋喃類藥物常見的有以下4種：呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林。硝基呋喃類物質(zhì)均為性質(zhì)穩(wěn)定的黃色粉末，無味或味微苦。硝基呋喃類原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速，其代謝產(chǎn)物分別為AOZ、AHD、AMOZ、SEM和蛋白質(zhì)結(jié)合而相當穩(wěn)定，故常利用代謝物的檢測來反應(yīng)硝基呋喃類藥物的殘留狀況[3]。

當前硝基呋喃類藥物的檢測方法分為四大類[4]：第一類是高效色譜分析法，包括液相色譜-紫外檢測器（LC-UV）、液相色譜熒光檢測器（LC-FLD）、超高效液相色譜法（UPLC）;第二類是質(zhì)譜聯(lián)用分析法，包括液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）;第三類是快速檢測法，包括酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)、化學發(fā)光免疫分析法（FI-CL）、熒光免疫法;第四類是光譜分析法。從上可以看出，硝基呋喃原藥及其代謝物的檢測方法種類繁多，綜合當前的研究成果，高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)靈敏度較高，定性定量準確，已成為水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物主要的檢測方法。

目前國內(nèi)頒布了有關(guān)硝基呋喃類代謝物的殘留檢測標準，主要有國家標準[5-7]、檢驗檢疫行業(yè)標準[8-9]、農(nóng)業(yè)行業(yè)標準[10-12]等。這些標準在實施期間被農(nóng)業(yè)部門、檢驗檢疫系統(tǒng)、進出口企業(yè)和其他相關(guān)部門廣泛采用。

本文以羅非魚基體以及陽性樣品作為實驗基體，在日常檢測的基礎(chǔ)上，對農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006（方法1）和國家標準GB/T 20752-2006（方法2）硝基呋喃類代謝物檢測標準進行比較，為動物源性水產(chǎn)品中硝基呋喃類殘留檢測提供一定的參考。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

樣品：本研究中使用的組織樣品為實驗室中未檢出4種硝基呋喃類代謝物的羅非魚作為陰性樣品。

試劑：標準品AOZ、AMOZ、AHD·HCl、SEM·HCl購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均高于98%;同位素內(nèi)標AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3購自上海安譜、SEM-13C-15N2購自德國Witega公司，純度均高于98%;甲醇和乙腈為HPLC級（德國默克公司）;乙酸乙酯、二甲亞砜、氫氧化鈉、2-硝基苯甲醛和乙酸銨為HPLC級（羅恩試劑）;磷酸氫二鉀為分析純（天津匯杭化工科技）;乙酸為優(yōu)級純（廣州化學試劑廠）;鹽酸為優(yōu)級純（上海安譜）;實驗用水為超純水。

2.2 儀器與設(shè)備

液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配ESI離子源（美國-Waters公司）;分析天平（瑞士-梅特勒-托利多）;LXJ-IIB 型離心機（上海安亭科學儀器廠）;渦旋振蕩器（德國-海道夫公司）;固相萃取裝置（美國-Waters公司）;氮吹儀（美國-ORGANOMATION公司）;恒溫振蕩器（常州智博瑞）;超純水機（美國-艾科浦公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 標準溶液、混合標準工作溶液、混合內(nèi)標工作溶液配制

標準溶液配制：稱取適量標準品，加甲醇溶解配制成濃度為100μg/mL的標準儲備液;移取適量儲備液，配制成1μg/mL的混合標準溶液;移取適量混合標準溶液用超純水稀釋，配置混合標準工作溶液，濃度為0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ng/mL。

內(nèi)標溶液配制：稱取適量內(nèi)標物，配制成濃度為100μg/mL的內(nèi)標標準儲備液;移取適量內(nèi)標儲備液，配制成1μg/mL的混合內(nèi)標溶液。將混合內(nèi)標溶液用超純水稀釋得100 ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液。

2.3.2 樣品制備

魚去鱗，去皮，沿背脊取其肌肉部分，經(jīng)搗碎機搗碎后，-18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 樣品提取與凈化

方法1：參照農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006，并適當進行改進。稱取樣品2.00g于50mL離心管，加入0.05mL混合內(nèi)標工作溶液，再加入5mL鹽酸溶液和0.15mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混勻50s后，置于恒溫水浴振蕩器中37℃ 避光振蕩16h。

取出離心管冷卻至室溫，加入4mL磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH至7.4，加入8mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50s，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上層清液至10mL玻璃離心管中，于40℃下氮氣吹干。準確加入1.0mL甲醇溶液溶解殘留物，過0.45μm 濾膜，待測。

方法2：參照GB/T 20752-2006標準。稱取2g均質(zhì)后的樣品于50mL離心管中，加入10mL甲醇-水溶液，均質(zhì)1min，再用5mL甲醇-水溶液洗滌均質(zhì)器刀頭，二者合并，4000r/min離心5min，棄掉上清液。

取出離心管冷卻至室溫，加入10mL濃度 0.2mol/L鹽酸溶液均質(zhì)1min，用10mL 濃度0.2mol/L鹽酸溶液洗滌均質(zhì)器刀頭，二者合并后加入0.3mL 衍生劑，用液體混勻器混勻，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器避光振蕩16h。

上述衍生物溶液放置室溫后，加入5mL濃度 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，用濃度1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，4000r/min離心10min，上清液經(jīng)固相萃取柱過柱，并用5mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于25mL棕色離心管中，在40℃ 水浴中用氮氣吹干，用樣品定容溶液溶解并定容至1.0mL，混勻后過0.2μm 濾膜，待測。

2.3.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8?m，2.1×100mm）;流速：0.4mL/min;柱溫：40℃;進樣量：1μL;流動相：0.1%甲酸溶液（含0.5mmol/L乙酸銨）（A相）和0.1%甲酸-乙腈（B相）;流動相梯度條件見表1。

2.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：ES+;毛細管電壓 （kV） 1.00;錐孔電壓（V） 35.00;離子源溫度（℃） 120;脫溶劑氣溫度（℃） 450;脫溶劑氣流量（L/Hr） 1000;其他質(zhì)譜參數(shù)見表 2。

3 結(jié)果與討論

3.1 數(shù)據(jù)的采集

樣品經(jīng)過酸解、衍生化和乙酸乙酯萃取凈化，質(zhì)譜掃描測定，內(nèi)標法定量。在同等質(zhì)譜條件下，分別進1μL濃度為10ng/mL的標準溶液，再分別進1μL經(jīng)過方法（詳見2.3.3 樣品提取與凈化）前處理后的空白樣品和加標濃度為2.5μg/kg的加標樣品提取液，色譜圖見圖1-（1-12）、和圖2-（1-12）。

3.2 線性關(guān)系和檢出限

3.2.1 線性關(guān)系

本試驗按照“2.3實驗方法”分別對標準系列工作溶液進行測定，每個濃度點測量1次，將峰面積比值與相應(yīng)標準溶液質(zhì)量濃度采用最小二乘法擬合標準曲線，得出測定結(jié)果及線性回歸方程詳見表3。當進樣量為1μL時，4種硝基呋喃類代謝物在0.5～10.0ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)表明，方法1略優(yōu)于方法2。

3.2.2 檢出限

在本試驗方法測定條件下，按照信噪比S/N=3所對應(yīng)濃度為依據(jù)計算檢出限（LOD），按信噪比S/N=10時的濃度得出定量限（LOQ），結(jié)果見表3。方法1降低了溶劑峰和基質(zhì)的干擾，檢出限明顯比方法2要低。

3.3 精密度試驗

使用陰性樣品的羅非魚作為空白樣品，添加2.5μg/kg的水平混合標準溶液，按照“2.3實驗方法”分別用方法1和方法2重復(fù)測定6次，計算其含量與相對標準偏差（RSD%），數(shù)據(jù)計算結(jié)果見表4。

由表4可見，兩種檢測方法的RSD均小于10%，均能滿足檢測需求。

3.4 加標回收率試驗

使用陰性樣品的羅非魚肌肉作為空白樣品，添加濃度2.5μg/kg的水平混合標準溶液，按照“2.3實驗方法”分別用方法1和方法2重復(fù)測定6次，分別計算4種硝基呋喃類代謝物的回收率與相對標準偏差（RSD%），數(shù)據(jù)計算結(jié)果見表5。

由表5得出，在相同加標濃度下，方法2除AOZ能達到95.3%，其余各化合物平均回收率均低于88.0%，回收率偏低;方法1在實驗分析過程中損失少，平均回收率均大于96%，回收率高，結(jié)果更穩(wěn)定準確。

4 結(jié)論

通過對比研究，兩種方法線性系數(shù)均大于0.998，線性關(guān)系良好。方法1各化合物的溶劑峰和基質(zhì)干擾少，檢出限均低于0.021?g/kg，比方法2低約3倍;方法1的回收率均在96.1%以上，且精密度比方法2要高，結(jié)果相對穩(wěn)定準確。當大批量實驗時，方法1可以節(jié)省大量操作時間和分析時間，實用性強，更適合快速測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的含量。

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