化肥減量配施有機(jī)肥下芒果園土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征

靳曉拓 馬繼勇 周彥妤 陳麗君 李濤 趙洪偉

摘 ?要 ?為了探究化肥減量配施有機(jī)肥對芒果園土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響。本研究以海南省樂東黎族自治縣某芒果園為研究對象，采用Illumina Miseq測序平臺，對化肥減量配施有機(jī)肥和常規(guī)施用化肥兩種施肥方式處理的芒果園土壤進(jìn)行16S rRNA高通量測序分析。結(jié)果表明：通過化肥減量配施有機(jī)肥處理的芒果園土壤的有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量和有效磷含量比常規(guī)施肥增加了54.87%、40.73%、64.17%，鎘和鉛含量分別比常規(guī)施肥減少了65.09%和68.81%，而汞和銅含量分別比常規(guī)施肥增加了74.19%和32.21%。基于97.00%的相似度對所得序列進(jìn)行聚類分析，2種處理的芒果園土壤中共有2702個operational taxonomic units（OTUs）。其中化肥減量處理的土壤平均有1784個OTUs，常規(guī)施肥處理的土壤平均有1568個OTUs?；蕼p量配施有機(jī)肥的施肥方式能顯著改善土壤質(zhì)量，提高芒果園土壤細(xì)菌豐富度和多樣性，并在一定程度上改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。施肥方式的改變對土壤細(xì)菌的分布有較大的影響，化肥減量處理的芒果園土壤中變形菌門、放線菌門的含量較高;兩種施肥方式下的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有了明顯的變化，但土壤中主要細(xì)菌的種類沒有改變，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)仍保持一定的相似性;相關(guān)性分析結(jié)果顯示土壤細(xì)菌群落受有機(jī)質(zhì)、有效氮、有效磷和銅含量的影響較大。

關(guān)鍵詞 ?化肥減量;芒果園土壤;16S rRNA;細(xì)菌多樣性;群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號 ?S154.3;X592 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?In order to study the effects on bacterial community structure and diversity in mango orchard soils through reducing the amount of fertilizer and increase the use of organic fertilizer， the Illumina Miseq high-throughput sequencing technique was used to sequence soil bacteria 16S rRNA from two treatments in Ledong， Hainan. The results showed that the contents of organic matter， alkali hydrolysis nitrogen and available phosphorus in mango orchard soil treated by fertilizer reduction and application of organic fertilizer increased by 54.87%， 40.73% and 64.17%， the contents of cadmium and lead decreased by 65.09% and 68.81% respectively， and the contents of mercury and copper increased by 74.19% and 32.21% respectively compared with conventional fertilization. Cluster analysis was performed on the sequences based on 97.00% similarity， and a total of 2702 operational taxonomic units （OTUs） were obtained from the mango orchard soils with two treatments. Among them， there were an average of 1784 OTUs in the soil treated with fertilizer reduction and 1568 OTUs in the soil treated with conventional fertilization. The fertilization method of decreasing the amount of fertilizer and applying organic fertilizer can significantly improve soil quality， increase the richness and diversity of soil bacteria in mango orchard soil， and change the community structure of soil bacteria to some extent. The change of fertilization method had a great influence on the distribution of soil bacteria. There were significant changes in the structure of soil bacterial community under the two fertilization methods， but the main bacterial species in the soil did not change， and the structure of soil bacterial community still maintained certain similarity. The results of correlation analysis showed that the soil bacterial community was mainly affected by the content of organic matter， available nitrogen， available phosphorus and copper.

Keywords ?fertilizer reduction; mango orchard soil; 16S rRNA; bacterial diversity; community composition

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.024

海南是我國最大的芒果種植區(qū)，種植面積超過4萬公頃芒果產(chǎn)業(yè)主要分布在海南南部地區(qū)，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的主要來源之一[1-2]。隨著芒果產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，其生產(chǎn)過程中過量使用化肥的問題日益嚴(yán)峻?；实牟缓侠硎褂脮茐耐寥澜Y(jié)構(gòu)、加速其養(yǎng)分流失、增加土壤重金屬及其他有毒元素的積累，降低土壤微生物多樣性，改變根際土壤中的細(xì)菌組成[3]?；实倪^量施用也是農(nóng)業(yè)面源污染的主要原因，過量的氮磷元素隨水體流失后進(jìn)入河流、湖泊和海洋等自然水體，使其水體呈富營養(yǎng)化，可誘發(fā)赤潮，水華等化境問題[4]。

隨著化肥施用量的增加，其造成的土壤退化問題和環(huán)境污染問題日益突出[5]，化肥減量增施有機(jī)肥的施肥方式將成為我國今后肥料施用的必然趨勢[6-7]?；逝涫┯袡C(jī)肥可顯著提高土壤微生物的生物量碳、氮及土壤酶活性[7]。有機(jī)肥和化肥的配合施用，不僅為土壤動物、植物和微生物提供了豐富的能源物質(zhì)，而且使養(yǎng)分得到釋放，增強(qiáng)土壤動物、植物和微生物的代謝活性[8]。目前關(guān)于化肥減量配施有機(jī)肥對獼猴桃果園土壤[9]、紅壤性水稻土壤[10]、茶園土壤[11]、棉花土壤[12]和柑橘土壤[13]等的影響都有研究。而關(guān)于化肥減量配施有機(jī)肥對芒果園土壤微生物多樣性的研究較少，陳瑞州等人采用平板培養(yǎng)法研究了有機(jī)肥替代部分化肥對芒果園土壤中微生物的數(shù)量的影響[14]，但平板培養(yǎng)法具有較大的局限性，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法得到的微生物只占環(huán)境微生物總數(shù)極少的一部分。目前的研究缺乏關(guān)于化肥減量配施有機(jī)肥對芒果園土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化情況，缺乏對芒果園土壤微生物整體和各類群間關(guān)系的了解。

本研究通過探究化肥減量配施有機(jī)肥和常規(guī)施肥的芒果園土壤中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化情況，闡明了2種施肥方式對芒果園土壤微生物整體和各類群間關(guān)系。研究結(jié)果可為化肥減量配施有機(jī)肥的施肥方式的推廣提供參考，為熱帶地區(qū)果園土壤微環(huán)境的改善提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?土壤樣品采集與處理

于2017年7月進(jìn)行土壤樣品的采集，采集方法參照《土壤農(nóng)化分析》[15]進(jìn)行，2個區(qū)域各設(shè)置3個采樣區(qū)，每個采樣區(qū)在樹冠滴水線區(qū)域內(nèi)設(shè)置10個采樣點(diǎn)，去除0～5 cm表層土壤，取5～ 25?cm的土壤并混合均勻。將采集的樣品標(biāo)記后置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。用四分法將采集的樣品分為2份：一份放置室內(nèi)自然風(fēng)干，用于土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、及重金屬含量的測定;一份放置于80?℃冰箱，提取DNA用于細(xì)菌16S rRNA測序分析。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗(yàn)設(shè)計 ?試驗(yàn)基地位于海南省樂東黎族自治縣黃流鎮(zhèn)某芒果園。該地區(qū)屬于熱帶季風(fēng)氣候，光熱充足，研究區(qū)域?yàn)樯叭榔降?，年平均氣溫?5?℃，年降雨量為1400～1800?mm。試驗(yàn)前芒果園土壤養(yǎng)分含量如下：有機(jī)質(zhì)10.45?g/kg，堿解氮為186.54?mg/kg，有效磷含量為89.56?mg/kg，速效鉀含量為152.45?mg/kg。本試驗(yàn)分為化肥減量配施有機(jī)肥區(qū)和常規(guī)施用化肥區(qū)，兩區(qū)域栽種的芒果品種均為貴妃芒，樹齡約5 a，芒果樹生長情況相似，株行距為3.5?m×3.5?m，芒果樹的基本特征：冠幅（2.0±0.3）m，胸徑（15.0±2.2）cm，株高（3.5±0.5）m，兩區(qū)域除施肥方式不同外，病蟲管理、雜草管理、果園修剪及覆蓋等處理方法均相同。

常規(guī)施用化肥組的化肥施用情況為尿素300?g/株，氯化鉀200?g/株，五氧化二磷200 g/株，根據(jù)果樹生長周期分4次施入，分別為攻梢肥（30%氮肥、40%磷肥、30%鉀肥），催花肥（20%氮肥、20%磷肥、20%鉀肥），壯花肥（20%氮肥、10%磷肥、10%鉀肥），壯果肥（30%氮肥、30%磷肥、40%鉀肥）。

化肥減量配施有機(jī)肥組以施用沼液為主，沼液由花生餅和廢棄魚蝦殘體經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生，在5月份和9月份施用。施用方法為：以沼液所含花生餅和魚蝦殘體總量計，花生餅每次4.0 kg/株，魚蝦殘體每次0.2 kg/株，輔以施用20%的常規(guī)施肥的化肥用量，化肥施肥方法同常規(guī)施肥處理。

1.2.2 ?土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量測定 ?土壤有機(jī)質(zhì)及堿解氮、有效磷、速效鉀檢測參照鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》[15]中的方法進(jìn)行：測定有機(jī)質(zhì)（SOM）采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法;測定堿解氮（AN）采用堿解擴(kuò)散法測定;有效磷（AP）采用0.05?mol/L HCl0.025 mol/L （1/2H2SO4）法進(jìn)行測定;速效鉀（AK）采用乙酸銨浸提，火焰光度法進(jìn)行測定。

1.2.3 ?土壤重金屬含量測定 ?重金屬鉻（Cr）、鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）、銅（Cu）和鋅（Zn）含量分析按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB15618-1995）進(jìn)行，鉻、鎘、鉛、銅和鋅采用火焰原子吸收分光光度法，汞采用原子熒光法進(jìn)行測定。

將PCR擴(kuò)增后的目的條帶回收，送至廣州賽哲生物科技股份有限公司利用Illumina Miseq測序平臺進(jìn)行16SrRNA序列測定。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

將測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags，同時對Reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)。使用Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的Raw Tags進(jìn)行過濾。使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。采用SPSS 24軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同施肥方式下土壤環(huán)境因子的變化

從表1可以看出，化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤的有機(jī)質(zhì)、堿解氮和有效磷含量均顯著高于常規(guī)施肥，有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量和有效磷含量比常規(guī)施肥增加了54.87%、40.73%、64.17%。2種施肥方式下的土壤pH和速效鉀含量沒有顯著差異。

從表2可以看出，化肥減量配施有機(jī)肥與常規(guī)施肥的芒果園土壤的重金屬含量存在較大差異，其中，化肥減量配施有機(jī)肥的果園土壤中鎘和鉛含量分別比常規(guī)施肥減少了65.09%和68.81%，顯著低于常規(guī)施肥;而汞和銅含量分別比常規(guī)施肥增加了74.19%和32.21%，顯著高于常規(guī)施肥;兩種施肥區(qū)域的鉻和鋅含量的差異不顯著。

2.2 ?不同施肥方式下測序結(jié)果

通過Illumina平臺進(jìn)行高通量測序，數(shù)據(jù)經(jīng)過優(yōu)化篩選后，共得到有效序列200?595條;對序列基于97.00%的相似度進(jìn)行聚類，共得到2702個OTUs。其中化肥減量配施有機(jī)肥的土壤中平均有1784個OTUs，平均有效序列34 757條;常規(guī)施肥的土壤中平均有1 568個OTUs，平均有有效序列32 108條。通過繪制稀釋曲線（rarefaction curve）來評價測序量是否足以覆蓋所有類群，同時間接反映樣品中物種的豐富程度。從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計這些序列所對應(yīng)的OTU數(shù)量，并以序列數(shù)與OTU數(shù)來繪制稀釋曲線（OTU rarefaction curve）（圖1）。圖1中的稀釋曲線趨于平緩，表示樣本中的OTU不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品的所有物種，測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

2.3 ?細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

通過對化肥減量配施有機(jī)肥的和常規(guī)施肥土壤的OTUs和Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析（表3）。每個OTU對應(yīng)不同的細(xì)菌種群，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)是微生物群落豐富度的重要指標(biāo)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是衡量微生物群落多樣性的重要指標(biāo)。從表3中可以看出，化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤的OTUs、菌群豐度指數(shù)（Ace和Chao指數(shù)）顯著高于常規(guī)施肥區(qū)域，表明化肥減量配施有機(jī)肥的土壤中物種的數(shù)量顯著多于常規(guī)施肥的區(qū)域;Shannon指數(shù)顯著高于常規(guī)施肥的土壤，Simpson指數(shù)顯著低于常規(guī)施肥的土壤，說明化肥減量配施有機(jī)肥的土壤細(xì)菌有更大的均勻度，其土壤細(xì)菌群落有更高的多樣性。

2.4 ?不同施肥方式下土壤細(xì)菌群落的主成分分析

對化肥減量配施有機(jī)肥和常規(guī)施肥的土壤成分進(jìn)行PCoA分析，并選取貢獻(xiàn)率最大的第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）進(jìn)行作圖（圖2），PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別是48%和26%。從圖2可以看出，2種施肥方式處理的樣品圍繞PC1軸完全分開，化肥減量配施有機(jī)肥的樣品分布在PC1的負(fù)軸，常規(guī)施肥的樣品分布在PC1的正軸，表明化肥減量配施有機(jī)肥和常規(guī)施肥的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。但二者的細(xì)菌群落在PC2上沒有區(qū)分開來，這說明兩種施肥方式的樣品仍然有較高的相似度。

2.5 ?不同施肥方式下主要細(xì)菌組成分析

為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)比對。除無法歸類的序列外，OTUs在門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類的平均比例97.49%、87.50%、74.54%、49.14%、15.51%、1.34%。在門分類水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）8門為化肥減量配施有機(jī)肥和常規(guī)施肥的土壤中平均相對豐度同時大于1%的8個優(yōu)勢門（圖3）。對兩組優(yōu)勢門平均相對豐度進(jìn)行差異分析表明，化肥減量配施有機(jī)肥的土壤的變形菌門、放線菌門和厚壁菌門的相對豐度與常規(guī)施肥相比有顯著差異。化肥減量配施有機(jī)肥的土壤中變形菌門和放線菌門的含量顯著高于常規(guī)施肥的土壤，但常規(guī)施肥的土壤中的厚壁菌門的相對豐度顯著高于化肥減量配施有機(jī)肥的土壤。化肥減量配施有機(jī)肥的施肥方式?jīng)]有改變主要細(xì)菌門的種類，但對土壤中部分優(yōu)勢細(xì)菌門的相對豐度有顯著影響。

2.6 ?不同施肥方式下細(xì)菌差異性分析

2.7 ?分析不同施肥方式下環(huán)境因子與細(xì)菌群落的相關(guān)性分析

對相似度97%的OTUs序列進(jìn)行去趨勢對應(yīng)分析后，根據(jù)CCA分析土壤環(huán)境因子、土壤樣本和土壤細(xì)菌群落三者之間的關(guān)系。選擇了AN、SOM、AP、Pb和Cu 5個環(huán)境因子進(jìn)行分析，可以解釋95.63%的菌群變化情況，其中CCA1解釋了77.17%，CCA2解釋了18.46%（圖5）。不同的環(huán)境因子對土壤細(xì)菌門的影響不同，有機(jī)質(zhì)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響最大，是影響土壤細(xì)菌

1. 酸桿菌門;2. 放線菌門;3. 擬桿菌門;4. 綠彎菌門;

5. 厚壁菌門;6. 芽單胞菌門;7. 浮霉菌門;8. 變形菌門。

1. Acidobacteria; 2. Actinobacteria; 3. Bacteroidetes;

4. Chloroflexi; 5. Firmicutes; 6. Gemmatimonadetes;

7. Planctomycetes; 8. Proteobacteria.

群落結(jié)構(gòu)的主效因子，且有機(jī)質(zhì)含量與堿解氮含量呈正相關(guān)。有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量與放線菌門和變形菌門相對豐度成正相關(guān)，與厚壁菌門的相對豐度呈負(fù)相關(guān);銅含量與放線菌門和變形菌門相對豐度呈負(fù)相關(guān);有效磷含量與酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門的含量呈正相關(guān)。

3 ?討論

本研究結(jié)果表明，化肥減量增施有機(jī)肥的施肥方式顯著改善了芒果園土壤質(zhì)量。在化肥減量增施有機(jī)肥的芒果園土壤中，土壤有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮和有效磷含量均顯著增加，這與邢鵬飛等[17]、李靜等[18]的研究結(jié)果一致。長期施用化肥可導(dǎo)致土壤中重金屬含量發(fā)生變化[19]，化肥中常見的重金屬有Pb、Cr和Zn等[20]，這可能是本研究中化肥減量配施有機(jī)肥的土壤中Cr和Pb的含量較低的原因。而化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤Cu和Hg的含量相對較高，可能與所施用的含魚蝦沼渣有關(guān)。近年來，水域環(huán)境中重金屬的污染狀況日益嚴(yán)重，而魚蝦等水產(chǎn)品對Cu、Cd、Hg、As等重金屬的富集能力較強(qiáng)[21]，其體內(nèi)重金屬含量較高[22-23]，本研究化肥減量配施有機(jī)肥區(qū)施用的有機(jī)肥為花生餅和魚蝦殘體發(fā)酵制成的沼液沼渣，可能是其土壤中Cu和Hg含量比常規(guī)施肥的果園中含量高的原因。

本研究中，化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤中，細(xì)菌豐度和多樣性顯著高于常規(guī)施肥處理，與孫家駿等[9]、陸海飛[10]的研究結(jié)果一致。汪潤地等[24]發(fā)現(xiàn)隨著有機(jī)肥的大量施用，土壤中的有機(jī)碳、氮和磷含量顯著提高，有利于土壤微生物的繁衍。有機(jī)肥增加了土壤細(xì)菌的多樣性，使適應(yīng)富營養(yǎng)環(huán)境的微生物參與了有機(jī)化合物的降解，且施肥方式的不同還影響對植物有益和有害微生物類群的相對豐度[25]。施用生物有機(jī)肥可在一定程度上提高獼猴桃土壤微生物的代謝多樣性和對碳源的利用能力[9]，顯著提高紅壤性水稻土壤細(xì)菌多樣性，并改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤中細(xì)菌豐度和多樣性顯著增加，可能與施加的有機(jī)肥有關(guān)。有機(jī)肥為土壤提供大量緩效養(yǎng)分，土壤中養(yǎng)分的變化對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，這些養(yǎng)分成為微生物生長所必需的食物。長期施用有機(jī)肥，可增加土壤細(xì)菌群落的多樣性，使土壤微生物量持續(xù)增加并改變土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)[26]。

土壤環(huán)境因子的變化會引起土壤微生物群落的變化，而微生物群落的變化也反作用于環(huán)境。本研究中化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤中硝化細(xì)菌如硝化桿菌科、硝化螺旋菌屬等含量較常規(guī)施肥高，與張信娣等[27]的研究結(jié)果相符，硝化細(xì)菌參與土壤中的氨氧化為硝酸的過程，這表明化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園的土壤質(zhì)量正在逐漸改善。本研究中，化肥減量配施有機(jī)肥的土壤中變形菌門和黃單胞桿菌目等含量較高。變形菌門具有促進(jìn)土壤氮肥利用、土壤修復(fù)和降解復(fù)合污染物等作用，其涵蓋了具有廣泛生理代謝類型的各種菌[28]。施用的有機(jī)肥為土壤中的變形菌門提供充足的養(yǎng)分，導(dǎo)致土壤中變形菌門的含量顯著增加[29]。黃單胞菌是使農(nóng)業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失的一類重要的植物病原菌，它們在世界上分布廣泛，能引起蔬菜和水果的各種疾病[30]。本研究同時發(fā)現(xiàn)，化肥減量配施有機(jī)肥的芒果園土壤中黃單胞菌含量比常規(guī)施肥高，說明本研究的化肥減量配施有機(jī)肥的施肥方式對該病原菌的控制能力較為薄弱，要警惕相關(guān)病原菌對芒果樹的侵害。

4 ?結(jié)論

化肥減量配施有機(jī)肥的施肥方式可顯著改善土壤質(zhì)量。在一年的種植期內(nèi)能夠顯著提高芒果園土壤中有機(jī)質(zhì)、堿解氮和有效磷的含量，降低土壤中Cr和Pb含量?；蕼p量配施有機(jī)肥的芒果園土壤細(xì)菌豐度和多樣性與常規(guī)施肥的土壤有顯著的差異。施肥方式的改變對土壤細(xì)菌的主要優(yōu)勢菌群豐度有較大的影響，兩種施肥方式下，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的變化，化肥減量配施有機(jī)肥的土壤中變形菌門和放線菌門的含量顯著高于常規(guī)施肥的土壤，厚壁菌門含量顯著低于常規(guī)施肥的土壤?；蕼p量配施有機(jī)肥的土壤中的硝化細(xì)菌、變形菌門和黃單胞菌的含量相對增加，但黃單胞菌的含量也有所增加，要警惕相關(guān)病原菌的侵害。

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