AQP4和rADC對低強度經(jīng)顱超聲治療大鼠缺血后腦水腫的療效評估

衣慧靈，杜娟,2，鄭濤，胡碩，李嘉麒，石清磊，劉蘭祥*

1.秦皇島市第一醫(yī)院核磁室，河北秦皇島 066000；2.河北醫(yī)科大學研究生學院，河北石家莊 050000；3.燕山大學，河北秦皇島06600；4.秦皇島市第一醫(yī)院骨科，河北秦皇島 066000；5.西門子有限公司磁共振產(chǎn)品事業(yè)部，北京 100000； *通訊作者 劉蘭祥liulanxiang66@sina.com

卒中是一種常見的腦血管疾病，發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高。急性缺血性卒中占卒中的60%～80%[1-2]，是由于腦血管突然阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一種疾病。近年來很多研究者嘗試用無創(chuàng)的物理方法如低強度經(jīng)顱超聲（low intensity pulsed transcranial ultrasound，LIPUS）刺激治療缺血性卒中取得了較好的療效，可能成為一種治療腦血管病的新方法[3-4]，但是利用影像方法評價其治療效果鮮有研究。有研究表明水通道蛋白 4（aquaporin 4，AQP4）的表達不同能反映LIPUS的治療效果，相對表觀擴散系數(shù)（relative apparent diffusion coefficient，rADC）的變化也能對LIPUS的治療效果進行評價。因此，本研究利用高分辨擴散成像動態(tài)評價大鼠腦缺血損傷不同時間點給予超聲刺激后，腦損傷區(qū)AQP4的表達情況及腦損傷區(qū)rADC的變化，從AQP4和影像方面評價LIPUS對超急性及急性腦梗死的治療效果，并探討 LIPUS減輕永久性大腦中動脈栓塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）后腦水腫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性 SD 成年大鼠[購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0006]40只，體重200～250 g，7周齡，分成4組，每組10只，建立dMCAO模型，對照組（A組）不給予超聲刺激，實驗組根據(jù)腦梗死分期分為超急性早期、超急性晚期和急性期，分別于模型后1 h、3 h、9 h給予超聲刺激，分別記為B組、C組和D組。本研究經(jīng)秦皇島市第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 動物模型制備 所有大鼠均用 3%戊巴比妥鈉（5 mg/100 g）腹腔麻醉后進行手術，使用改良的Longa法制作大鼠永久性 dMCAO腦缺血模型，術前 12 h禁食不禁水。仰臥位固定后行頸部正中縱行切口；游離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈并掛線標記；夾閉右側頸總動脈，結扎頸外動脈近心端和遠心端，中間剪斷，于殘端剪一小口，插入線栓，稍感阻力時停止進線，進線深度約18～19 mm；術中采用麻醉藥維持劑量≤0.2 ml/（kg·h），電熱毯加熱保持大鼠體溫在（38.0±0.5）℃。模型制作完畢后將大鼠頭頂右側皮毛剪開，暴露顱骨以便給予超聲刺激。

1.3 超聲刺激實驗 采用一種商業(yè)經(jīng)顱超聲電療儀（DK-102T，中國渡康醫(yī)療器械有限公司）給予大鼠超聲刺激。非聚焦超聲傳感器的面積為3.5 cm2，總刺激持續(xù)時間為10 min。超聲波的基本頻率和脈沖重復頻率分別為800 kHz和1 kHz。超聲波持續(xù)時間和相互刺激間隔時間分別為10 ms和100 ms。超聲波空間峰脈沖平均強度為1.2 W/cm2[5-6]。實驗組分別于模型后1 h、3 h、9 h給予超聲刺激。

1.4 MRI檢查 采用Siemens 3.0T MR掃描儀，動物專用線圈，將各組大鼠麻醉后取俯臥位，頭部置入線圈中央行冠狀位掃描。擴散加權成像（DWI）序列掃描參數(shù)：TR 5000 ms，TE 70 ms，翻轉角150°，層厚2.2 mm；體素1.0 mm×1.0 mm×2.2 mm，視野98 mm×98 mm，b值分別為 0、1000 s/mm2。TSE-T2WI序列掃描參數(shù)：TE 113 ms，TR 3530 ms，翻轉角150°，層厚2.2 mm，體素0.3 mm×0.3 mm×2.2 mm，視野74 mm ×74 mm。

圖像分析在后處理工作站上（德國西門子公司），感興趣區(qū)（ROI）選擇異常信號灶最大且包括兩側側腦室的層面及對側半球相應部位并測量其ADC值，由2名影像科醫(yī)師分別進行測量，計算組內(nèi)相關系數(shù)（ICC）>0.8，結果信度良好。為避免因梗死部位對實驗結果產(chǎn)生的影響，計算時采用病變側與正常側的比值，即rADC值。ADC值=ln（S1-SO）/（bO-b1），其中S1為b=1000 s/mm2的信號強度，SO為b=0的信號強度，ln：自然對數(shù)；rADC值=ROI的ADC值/對側ADC值×100%。ROI均為2 mm2。

1.5 病理學檢查

1.5.1 TTC染色 MRI掃描后每組取2只，麻醉后斷頭取腦。把腦組織冷凍20 min后切成2 mm的冠狀位切片，浸在2% TTC溶液中，放入37℃水浴箱中加熱20 min，取出后放入10%多聚甲醛磷酸緩沖液固定24 h，固定后取出切片觀察模型的腦缺血情況。

1.5.2 免疫組織化學染色 除去行 TTC染色的大鼠，其他均在麻醉后用4℃、4%多聚甲醛溶液灌流取腦，腦組織置于 4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋后做冠狀切片。按照 Axiotis等[7]的方法進行染色分析，在顯微鏡下觀察。在4組大鼠的右腦皮質(zhì)中隨機選取 20個視野，2名免疫學專家評估免疫組織化學染色強度百分比。用二甲苯和不同濃度的酒精常規(guī)脫蠟，用HE染色，每張切片隨機選取4個高倍視野（×400）。

AQP4免疫組織化學染色半定量結果按陽性細胞百分比表達：0為 0～10%，1+為 11%～25%，2+為26%～50%，3+為51%～75%，4+為76%～100%。免疫染色強度半定量分析：1+為染色較弱，2+為適度染色，3+為染色較強。將這兩種評分方法的結果相加，得到以下評分：0～2分為弱表達，3～5分為中度陽性表達，6～7分為強陽性表達。計算20個視野的平均值，并將結果四舍五入到最接近的整數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AQP4表達情況 A、B、C、D組的AQP4陽性細胞百分比分別為 87%、67%、65%、88%，評分分別為（7±2）分、（3±1）分、（4±2）分、（6±2）分。A組和D組陽性細胞百分比和平均分接近，AQP4具有較強的陽性表達。B組和 C組在 LIPUS治療下AQP4陽性細胞百分比和平均分均降低。在腦缺血后1 h給予超聲刺激治療后AQP4陽性染色細胞密度降低最明顯，A組平均染色分數(shù)在6～7分，B和C組的平均染色分數(shù)均在3～4分，D組平均染色分數(shù)在6～7分，表明AQP4在對照組及9 h超聲治療組的細胞中有較強的陽性表達（圖1）。

圖1 4組大鼠腦AQP4免疫組化染色結果（×400）。A組和D組見較強的AQP4表達，較B組和C組染色明顯，陽性細胞數(shù)量多

2.2 AIS大鼠右側大腦梗死區(qū)域rADC值及TTC染色結果 dMCAO建模后12 h，A組、B組、C組及D 組大鼠腦 rADC 值分別為 0.24±0.15、0.39±0.22、0.42±0.29及 0.23±0.18，B組、C組明顯高于 A 組（P=0.016、0.018），D組與A組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.850）。TTC染色結果顯示，右側大腦半球腦組織顯示白色區(qū)域為梗死區(qū)。

圖2 大鼠腦急性腦缺血MRI及TTC染色結果。A～C分別是冠狀位T2WI、冠狀位高分辨擴散成像、冠狀位rADC MR圖像，D為TTC染色結果。MRI圖像表明右側大腦中動脈栓塞后出現(xiàn)大面積急性腦梗死，TTC染色圖與其對應

3 討論

3.1 LIPUS對急性腦水腫的調(diào)控 腦水腫指腦組織中水分子的異常聚集，從而引發(fā)腦腫脹。腫瘤、創(chuàng)傷以及腦血管疾病等多種顱內(nèi)病理變化均能導致腦水腫的發(fā)生，嚴重的腦水腫則可能導致腦疝，從而危及患者生命[8]。目前臨床上仍然以甘露醇等藥物作為缺血后腦水腫的首選治療方法，但其效果受到血-腦屏障通透性和肝臟代謝的影響。LIPUS作為近十年內(nèi)新的腦病治療方法，已在腦腫瘤、癲癇、阿爾茨海默病和帕金森病等治療中發(fā)揮了獨特的作用[9-10]。既往研究將LIPUS用于創(chuàng)傷后腦水腫的調(diào)節(jié)，并取得了突出的療效[11-12]。

LIPUS指用低強度超聲穿透完整的大腦顱骨從而達到對腦血管和腦神經(jīng)功能調(diào)制的一種技術，它具有無損傷、可調(diào)節(jié)、高刺激深度、高空間分辨率、無永久副作用等優(yōu)點[13]。Guo等[14]研究證明LIPUS可調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)活動，提高腦血氧飽和度并增加腦血流量，降低腦組織腦缺血損傷。Li等[4]研究表明，在缺血性卒中發(fā)作后立即給予超聲波刺激可促進血液供應，減小缺血面積。

3.2 rADC和AQP4聯(lián)合評估LIPUS的療效 DWI作為一種能夠在疾病早期（6 h以內(nèi)）甚至在超早期明確顯示梗死區(qū)域的 MRI技術，是診斷急性缺血性卒中的“金標準”。采用rADC評價不同個體間的病變狀態(tài)更具有可比性[15]。Copen等[16]通過研究腦梗死rADC的散點圖和時程表對發(fā)病時間作出估計，發(fā)現(xiàn)rADC值是對腦梗死灶性質(zhì)進行量化的一個指標，可以更客觀地反映病灶的時程。Unruh等[17]報道AQP與腦水腫的發(fā)生密不可分。在哺乳動物腦中最主要的是AQP4，其與腦脊液的產(chǎn)生和重吸收有關，調(diào)控腦水腫發(fā)生極性，即在靠近血管內(nèi)皮細胞的星形膠質(zhì)細胞終足膜上出現(xiàn)大量表達，使腦水腫明顯加重；下調(diào)APQ4則可以減輕腦水腫的程度，提示AQP4是膠質(zhì)細胞與腦脊液及血管之間水轉運和調(diào)節(jié)的重要結構基礎，是腦水腫中重要的靶蛋白[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在dMCAO后1 h、3 h給予LIPUS刺激，可使AQP4表達明顯下調(diào)，rADC值增大。B組、C組APQ4免疫組化評分均低于A組，B組和C組APQ4免疫組化評分無顯著差異。Manley等[19]進行的腦缺血損傷實驗發(fā)現(xiàn)，剔除AQP4基因后的小鼠腦水腫形成程度較對照組明顯減輕，小鼠的神經(jīng)功能缺損程度也相應地減輕。Igarashi等[20]采用AQP4抑制劑 TGN-020預處理腦缺血小鼠模型，發(fā)現(xiàn)抑制腦缺血小鼠AQP4的表達可減輕缺血后腦水腫和腦梗死程度。推測LIPUS刺激可能引起腦組織的血管舒張，進而增強大腦受損區(qū)域的血流，抑制細胞毒性水腫減輕細胞腫脹，使細胞間隙的縮小有所改善，減緩rADC值下降，使AQP4表達下調(diào)，從而減輕腦水腫。LIPUS對超急性早、晚期腦缺血均有明顯的治療效果。dMCAO后9 h給予LIPUS刺激，AQP4表達及rADC值與對照組比較均無顯著差異。分析隨著缺血時間延長到9 h后，會出現(xiàn)胞膜破裂，細胞內(nèi)細胞器等有形結構破壞，缺血區(qū)酸中毒，并導致不可逆的缺血性腦損傷[21-22]，因此 LIPUS對急性期腦缺血治療效果不明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管dMCAO模型大鼠腦組織中AQP4表達可以反映 LIPUS治療大鼠超急性期及急性期腦缺血后腦水腫的變化，但本研究對LIPUS影響 AQP4的機制尚不十分清晰，對 AQP4的極性表達未進行深入探討。下一步將繼續(xù)對AQP4蛋白進行更精細化的研究，為治療腦缺血水腫提供新思路，為研發(fā)理想的腦缺血治療方案提供新的靶標。