超聲微泡介導(dǎo)的空化效應(yīng)改善急性缺血組織局部灌注的實(shí)驗(yàn)研究

邱世鋒，楊莉，李丹霞，曹世平，查道剛，吳爵非

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州 510515； *通訊作者 查道剛 zha@smu.edu.cn

近年來，診斷超聲聯(lián)合微泡輔助聲學(xué)溶栓改善血流灌注已逐漸成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。研究表明，聲學(xué)溶栓在外周血管溶栓[1-2]及冠狀動(dòng)脈閉塞再通[3]方面療效較好，能增加血流灌注、改善局部微循環(huán)。荷蘭、巴西的小規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)聲學(xué)溶栓在急性心肌梗死患者的有效性及安全性[4-5]。同時(shí)，研究證實(shí)超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)在慢性下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭锌稍黾又w缺血組織灌注和輻照區(qū)域的局部血流[6-8]，這種方法稱為“聲學(xué)輔助灌注”。

本研究擬建立貼近臨床的大鼠下肢急性缺血模型，以探討超聲間斷高機(jī)械指數(shù)脈沖聯(lián)合靜脈滴注微泡介導(dǎo)的空化效應(yīng)對(duì)急性缺血組織灌注的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性SPF級(jí)SD大鼠24只，體重 180～250 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44002100016439）。本研究獲得南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 微泡混懸液制備 采用南方醫(yī)院自制脂質(zhì)微泡，由二棕櫚磷脂酰膽堿（DPPC）、二棕櫚酰磷脂酸（DPPA）、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 500（DPPE-PEG 500）、甘油、1,2-丙二醇等脂質(zhì)材料及全氟丙烷氣體按一定比例制得。庫爾特計(jì)數(shù)器（MultisizerⅢ，美國(guó)）測(cè)得微泡濃度為（2.98±0.17）×109/ml，平均直徑為（2.45±0.14）μm。取2.5 ml微泡與7.5 ml生理鹽水預(yù)混稀釋成微泡混懸液，超聲造影中用微量泵以400 μl/min緩慢靜脈輸注微泡混懸液，治療過程中以600 μl/min持續(xù)輸注。

1.3 建立大鼠急性下肢缺血模型 腹腔注射3%戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定于恒溫鼠板，維持體溫37℃，備皮、消毒。采用無菌操作于大鼠左側(cè)下肢腹股溝韌帶下緣作一長(zhǎng)約 1.5 cm的縱行切口，分離左側(cè)髂外動(dòng)脈及其分支后，在髂外動(dòng)脈遠(yuǎn)端進(jìn)行結(jié)扎10 min，同時(shí)避免損傷周圍靜脈及神經(jīng)，右側(cè)下肢不做處理。結(jié)扎大鼠左側(cè)髂外動(dòng)脈10 min后，超聲造影觀察到結(jié)扎側(cè)下肢血流灌注減少 50%以上（平臺(tái)期微泡充盈面積較基線減少50%以上），表明大鼠急性下肢缺血模型建立成功。分離出頸靜脈，在頸靜脈內(nèi)作一“V”形切口，插入PE50管，建立大鼠靜脈輸液通道。

1.4 超聲參數(shù)設(shè)定 ①成像超聲參數(shù)設(shè)定：使用西門子Sequoia 512超聲診斷儀，17L5探頭，選擇對(duì)比脈沖序列（CPS）模式，調(diào)整圖像增益，調(diào)整成像超聲頻率為7.0 MHz，機(jī)械指數(shù)（MI）為0.18，動(dòng)態(tài)范圍為55 dB，選擇大鼠下肢橫切面（以髕骨上緣為垂足，垂直股骨的橫切面）成像，調(diào)整切面至圖像滿意后，固定探頭，造模前、造模后和治療后均對(duì)大鼠雙下肢進(jìn)行低機(jī)械指數(shù)實(shí)時(shí)超聲造影成像。②治療超聲參數(shù)設(shè)定：使用西門子Sequoia 512超聲診斷儀，17L5探頭，選擇D Color模式，調(diào)整成像超聲頻率為10.0 MHz，MI為1.9，每次高機(jī)械指數(shù)脈沖破壞（flash）持續(xù)時(shí)間為3 s，間歇時(shí)間為5 s。

1.5 實(shí)驗(yàn)方案 按照不同治療方法將大鼠隨機(jī)分為3組，每組各8只。①空化組（超聲+微泡）：予間斷高機(jī)械指數(shù)脈沖聯(lián)合靜脈滴注微泡 10 min；②單純超聲組：僅予間斷高機(jī)械指數(shù)脈沖10 min，無持續(xù)靜脈滴注微泡；③單純微泡組：僅予持續(xù)靜脈滴注微泡10 min，無間斷高機(jī)械指數(shù)脈沖。

經(jīng)靜脈通道持續(xù)泵入微泡，連續(xù)成像超聲進(jìn)行雙下肢同步超聲造影灌注基礎(chǔ)成像，存取為雙下肢基線。結(jié)扎大鼠左側(cè)髂外動(dòng)脈，采用超聲造影成像觀察結(jié)扎側(cè)下肢血流灌注減少50%以上（平臺(tái)期微泡充盈面積較基線減少50%以上），等待10 min后行超聲造影灌注成像。將大鼠雙下肢同時(shí)在不同條件下持續(xù)治療，治療10 min后立即再次行超聲造影灌注成像。

1.6 圖像分析 全部造影圖像存儲(chǔ)于光盤，根據(jù)美國(guó)Virginia大學(xué)創(chuàng)立的經(jīng)典方法[9]，使用MCE軟件（俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)，美國(guó)）對(duì)造影圖像進(jìn)行脫機(jī)分析。人工描繪大小、形態(tài)及位置一致的骨骼肌灌注區(qū)為感興趣區(qū)（ROI），根據(jù)對(duì)比劑在局部組織的聲強(qiáng)度與時(shí)間間隔函數(shù)關(guān)系 Y（t）=A×[1-e（-β×t）]，計(jì)算骨骼肌的平臺(tái)聲強(qiáng)度（A值）和對(duì)比劑再充填速率（β值），A值反映局部微血管血流容積（相當(dāng)于毛細(xì)血管密度），β值反映微泡在局部組織毛細(xì)血管流動(dòng)的速度；兩者的乘積（A×β）代表局部組織微血管的血流量（microvascular blood flow，MBF）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，同一治療組同側(cè)下肢不同時(shí)間血流灌注情況比較采用單因素方差分析；同一治療組不同下肢同一時(shí)間血流灌注情況比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不同組別同側(cè)下肢同一時(shí)間血流灌注情況比較采用單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用Bonferroni方法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空化前后的超聲造影圖像 空化組雙下肢空化前后的超聲造影圖像見圖1。造模前，缺血側(cè)和正常側(cè)血流灌注的充盈時(shí)間相似。造模后（即空化前），缺血側(cè)血流灌注的充盈時(shí)間延長(zhǎng)，高于正常側(cè)（P<0.05）?？栈?，缺血側(cè)的充盈時(shí)間仍高于正常側(cè)（P<0.05）。對(duì)于缺血側(cè)，空化后血流灌注的充盈時(shí)間明顯較空化前提前（P<0.05）（表1）。

圖1 空化組大鼠雙下肢空化前（A）與空化后（B）的超聲造影圖像。正常側(cè)：空化前后約8 s達(dá)血流灌注充盈穩(wěn)態(tài)；缺血側(cè)（紅色方框內(nèi)）：空化前14 s達(dá)充盈穩(wěn)態(tài)，空化后提前至11 s達(dá)充盈穩(wěn)態(tài)

表1 空化組大鼠雙下肢平均血流灌注充盈時(shí)間比較（±s，s）

表1 空化組大鼠雙下肢平均血流灌注充盈時(shí)間比較（±s，s）

注：與造模前比較，*P<0.05；與空化前比較，ΔP<0.05；與正常側(cè)比較，#P<0.05

部位 造模前 空化前 空化后缺血側(cè)（n=8） 8.13±0.69 14.19±0.84*# 11.38±1.25Δ#正常側(cè)（n=8）8.10±0.818.29±0.678.25±0.83

空化組雙下肢 ROI內(nèi)空化前后定量分析擬合的時(shí)間-強(qiáng)度曲線見圖 2?？栈笕毖獋?cè) A值、β值和MBF均較空化前明顯增加，主要表現(xiàn)為A值增加；而正常側(cè)空化后A值、β值基本同前。

2.2 3組缺血側(cè)A值、β值及MBF的變化 造模前，3組缺血側(cè)與正常側(cè)的超聲造影成像中A值、β值和MBF差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05，表2），提示各組大鼠造模前雙下肢血流灌注一致，排除實(shí)驗(yàn)前自身有周圍動(dòng)脈疾病的大鼠。

造模后，超聲造影成像見缺血側(cè)平臺(tái)期微泡充盈面積較基線減少50%以上，且血流灌注達(dá)到充盈穩(wěn)態(tài)時(shí)間明顯延長(zhǎng)；缺血側(cè)血流灌注較結(jié)扎前顯著減少（65.0±9.3）%（P<0.001）。

治療后，空化組缺血側(cè)A值明顯高于治療前（P<0.05），甚至超過基線（P<0.05），β值、MBF也高于治療前（P<0.05）。超聲組治療后缺血側(cè)A值、β值和MBF較治療前略增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而微泡組治療后缺血側(cè)A值、β值和MBF均無顯著變化（P>0.05）（表2）。

空化組缺血側(cè)空化后A值（F=72.354，P<0.001）、MBF（F=37.781，P<0.001）明顯高于超聲組和微泡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但 β值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.941，P>0.05）。

2.3 3組正常側(cè)A值、β值及MBF的變化 對(duì)于正常側(cè)（非缺血性）下肢，造模前與造模后超聲造影見平臺(tái)期微泡充盈面積及血流灌注充盈時(shí)間均無明顯變化。空化治療后，空化組正常側(cè)組織血流灌注也較前輕度增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），主要表現(xiàn)為β值增加，A值無明顯變化。而超聲組中正常側(cè)組織血流灌注也較前輕微增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而微泡組中正常側(cè)微循環(huán)血流灌注基本無改變（P>0.05）（表2）。

圖2 空化組大鼠雙下肢空化前（A）與空化后（B）的時(shí)間-超聲造影強(qiáng)度曲線

表2 各組大鼠下肢缺血側(cè)和正常側(cè)A值、β值及MBF比較（±s）

表2 各組大鼠下肢缺血側(cè)和正常側(cè)A值、β值及MBF比較（±s）

注：與基線比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05

分組A值（dB） β值（/s）MBF（dB/s）基線 治療前 治療后 基線 治療前 治療后 基線 治療前 治療后空化組（n=8）缺血側(cè)65.73±4.1950.82±3.48*69.53±2.32#0.28±0.040.16±0.02*0.19±0.04#18.20±1.196.45±1.69*13.08±1.44#正常側(cè)66.02±4.1466.25±3.2566.75±2.910.27±0.030.27±0.030.29±0.0318.00±1.5217.72±1.2418.76±1.02超聲組（n=8）缺血側(cè)65.75±4.5949.88±3.66*44.63±3.110.28±0.040.13±0.01*0.16±0.0218.32±1.596.49±1.66*6.96±1.11正常側(cè)65.88±4.7066.00±4.3465.88±3.440.27±0.010.28±0.010.28±0.0318.04±1.7018.16±1.3418.61±1.44微泡組（n=8）缺血側(cè)65.13±6.4848.13±4.27*39.23±3.480.29±0.020.13±0.01*0.16±0.0218.53±1.386.42±1.27*6.32±1.48正常側(cè)65.46±4.4565.50±5.7466.13±5.890.28±0.040.28±0.020.28±0.0218.15±1.4518.30±1.7418.33±1.79

3 討論

近年來，超聲聯(lián)合微泡的臨床應(yīng)用越來越廣泛，超聲造影可定量評(píng)估不同器官的微循環(huán)灌注改變[10-11]，靶向微泡聯(lián)合超聲可以更精準(zhǔn)有效地進(jìn)行腫瘤的靶向治療，靶向超聲聯(lián)合微泡有望通過血-腦屏障治療部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12]。在高能量超聲作用下，微泡會(huì)產(chǎn)生劇烈共振，甚至破裂，稱為微泡的空化效應(yīng)[3]。由于微泡可以通過微循環(huán)，在低能量超聲下發(fā)生共振壓縮，因而可以放大微循環(huán)中內(nèi)皮細(xì)胞或紅細(xì)胞介導(dǎo)的剪切力及機(jī)械力，進(jìn)而增加局部組織血流，稱為“聲學(xué)輔助灌注”[6-8]。

聲學(xué)輔助灌注越來越受到關(guān)注，并試圖探索其在心血管疾病或嚴(yán)重外周動(dòng)脈疾病中發(fā)生的急性或慢性缺血組織中增加血流灌注的臨床價(jià)值。Belcik等[6-7]研究證實(shí)，聲學(xué)輔助灌注可使小鼠慢性缺血下肢組織灌注增加 2倍，在患外周動(dòng)脈疾病的小鼠模型中逆轉(zhuǎn)組織缺血長(zhǎng)達(dá) 24 h，并且使鐮狀細(xì)胞病患者的組織灌注加倍，其潛在機(jī)制可能是空化介導(dǎo)的eNOS活化和剪切力增加。在大鼠下肢止血帶結(jié)扎的缺血模型或犬左前降支閉塞模型中，27 kHz超聲可通過磷酸化eNOS（p-eNOS）和NO的產(chǎn)生改善灌注。機(jī)械壓力和剪切力增加可以激活 NOS，并增加內(nèi)皮 NO的產(chǎn)生[13]。然而，既往大多數(shù)研究均集中在慢性缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜕稀?/p>

本研究為國(guó)內(nèi)首次在急性下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜕咸剿鳎^察到聲學(xué)輔助灌注可以改善急性缺血肢體組織灌注。

通過對(duì)比雙下肢的超聲造影圖像發(fā)現(xiàn)，缺血側(cè)大動(dòng)脈血流灌注明顯減少，血流灌注充盈穩(wěn)態(tài)時(shí)間延長(zhǎng)，但微循環(huán)的血流灌注無明顯減少；空化后，缺血側(cè)大動(dòng)脈血流灌注無明顯增加，但微循環(huán)的血流灌注明顯增加且充盈加快，血流灌注充盈穩(wěn)態(tài)時(shí)間提前。結(jié)合時(shí)間-超聲造影強(qiáng)度曲線分析，缺血側(cè)空化后A值、β值明顯增加，但以A值增加為主。故推測(cè)聲學(xué)輔助灌注改善急性缺血肢體組織灌注，主要是通過增加局部微血管血流容積（A值），即增加微循環(huán)灌注，進(jìn)而增加輻照區(qū)域的局部血流。因擴(kuò)張大動(dòng)脈的程度不明顯，故血流速度（β值）增加程度不如A值。

既往研究在慢性缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜕献C實(shí)，超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)的空化效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)了動(dòng)脈擴(kuò)張的程度，其機(jī)制可能是超聲的空化效應(yīng)和微泡的增強(qiáng)作用增加了機(jī)械壓力和剪切力，從而激活NOS并增加內(nèi)皮NO的產(chǎn)生，進(jìn)而擴(kuò)張血管增加血流灌注[6-7,13]。此外，Goyal等[14]在微血管阻塞的體外和體內(nèi)模型中證實(shí)了空化治療后可恢復(fù)灌注，提示改善微循環(huán)灌注的重要性。

造模后，缺血側(cè)A值、β值和MBF均下降。但缺血側(cè)血流灌注顯著減少主要體現(xiàn)在β值明顯減少，反映了結(jié)扎后缺血下肢小動(dòng)脈及微循環(huán)血流充盈速度明顯減慢；A值下降提示下肢缺血后因組織灌注不足有部分微血管關(guān)閉，從而導(dǎo)致微血管血流容積減少；結(jié)合超聲造影圖像及時(shí)間-強(qiáng)度曲線可見，MBF下降主要是微循環(huán)灌注明顯減少。

空化治療后，大鼠缺血側(cè)MBF增加1倍多，A值較治療前明顯增加，甚至超過基線值，β值也明顯增加，但增加幅度不如A值；超聲造影圖像見缺血側(cè)大動(dòng)脈血流灌注無明顯增加，但微循環(huán)的血流灌注明顯增加且充盈加快，血流灌注充盈穩(wěn)態(tài)時(shí)間提前，提示空化效應(yīng)可能是短暫性擴(kuò)大動(dòng)脈直徑，使血流充盈速度加快，一定程度上提高了血流灌注壓使部分微血管開放，代償性增加微血管血流容積，從而改善微循環(huán)灌注，進(jìn)而增加急性缺血組織血流灌注。

超聲組治療后缺血側(cè)組織血流灌注僅稍增加，證實(shí)超聲對(duì)缺血組織有一定的治療作用；微泡組中治療后缺血側(cè)微循環(huán)血流灌注基本無明顯改變，提示單純的微泡僅有超聲造影的作用。因此，空化效應(yīng)改善急性缺血組織灌注的效果明顯優(yōu)于單純超聲治療和單純微泡治療。

因此，這種聲學(xué)輔助灌注的效應(yīng)不僅通過擴(kuò)張大血管，也有選擇性地在微血管水平產(chǎn)生影響，從而改善微循環(huán)灌注及缺血組織缺血缺氧的情況，減輕氧化應(yīng)激等組織損傷過程，進(jìn)而對(duì)缺血組織起到一定的保護(hù)作用。盡管這種效應(yīng)有可能是短暫存在或有時(shí)效性[8]?？傊?，聲學(xué)輔助灌注可有效改善急性缺血組織局部血流灌注。聲學(xué)輔助灌注和聲學(xué)溶栓作為非侵入性治療，未來在臨床上有望應(yīng)用于急性或慢性缺血性心血管疾病[6-7,15]，其改善急性缺血組織灌注的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。