載硫化鉍葉酸靶向相變型超聲/光聲雙模態(tài)對(duì)比劑體外尋靶及顯像研究

周頔，王志剛，文明，呂發(fā)金，李詠梅*

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010； *通訊作者 李詠梅lymzhang70@aliyun.com

目前，靶向相變型多功能納米粒以其能實(shí)現(xiàn)液氣相變而增強(qiáng)多模態(tài)顯像以及高度特異性識(shí)別靶標(biāo)而備受關(guān)注[1]。全氟己烷（perfluorohexane，PFH）是相變型分子探針最常用的核心材料，當(dāng)其受外界條件一定的刺激時(shí)，介質(zhì)受熱局部溫度升高超過液態(tài)氟碳相變閾值，發(fā)生液-氣相轉(zhuǎn)變，從而增強(qiáng)超聲顯影[2]。近年來，一種新興的無創(chuàng)醫(yī)學(xué)成像方法光聲成像成為研究熱點(diǎn)，它兼具了聲學(xué)成像和光學(xué)成像的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)靶區(qū)具有更高的穿透深度和圖像分辨率[3]。硫化鉍（bismuth sulfide，Bi2S3）是一種新型的納米生物材料，在近紅外光波長激光作用下能吸收光能實(shí)現(xiàn)光聲顯像[4]，展示了作為光聲成像增敏劑的潛能。此外，多數(shù)上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體，腫瘤組織特異性高。當(dāng)葉酸分子與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體特異性結(jié)合時(shí)，能實(shí)現(xiàn)多功能分子探針在腫瘤組織的靶向遞送，增加分子探針在腫瘤部位富集量，實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像引導(dǎo)下的精準(zhǔn)治療，提高治療效果[5]。因此，本研究設(shè)計(jì)偶聯(lián)葉酸的乳酸/羥基乙酸共聚物高分子材料包裹PFH及Bi2S3，制備葉酸靶向相變型載 Bi2S3納米粒（folate receptor-targeted phase-shift nanoparticles carrying bismuth sulfide，F(xiàn)PBS-PFHNPs），探討其體外尋靶、相變及超聲/光聲雙模態(tài)顯像能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolicacid-folate，PLGA-FA，重慶浦諾維生物科技有限公司）、PFH（美國Avanti公司）、乳酸/羥基乙酸共聚物（PLGA，重慶浦諾維生物科技有限公司）、Bi2S3（中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所）、聚乙烯醇（PVA，美國Sigma公司）、DiO熒光染料（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、DiI熒光染料（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、電子天平（上海精天電子儀器有限公司）、超聲聲振儀（美國SONICS & MATERIALS公司、高速分散均質(zhì)機(jī)（FJ300-SH，上海）、高速冷凍離心機(jī)（德國Ependorf公司）、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、激光粒徑儀（美國Malvern公司）、JC型高強(qiáng)度聚焦超聲治療系統(tǒng)（重慶海扶技術(shù)有限公司）、Vevo laser光聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司）。

1.2 FPBS-PFH-NPs的制備 將50 mg PLGA-FA與500 μl Bi2S3溶于 10 ml三氯甲烷中，再加入 200 μl PFH后冰浴環(huán)境下聲振60 s，再加入5 ml 4% PVA溶液，高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min，然后加入20 ml 2%異丙醇，旋蒸1～2 h，離心洗滌2次（5000 r/min，5 min），棄上清液和底層未包裹的Bi2S3，得到載Bi2S3葉酸靶向相變型納米粒（FPBS-PFH-NPs），保存于4℃冰箱備用。在聲振之前的連續(xù)相中加入少量DiI則可制備帶熒光的FPBS-PFH-NPs。按照上述方法分別制備載Bi2S3非靶向相變型納米粒（non-folate receptortargeted phase-shift nanoparticles carrying bismuth sulfide，NPBS-PFH-NPs）組、未載Bi2S3葉酸靶向相變型納米粒（folate receptor-targeted phase-shift nanoparticles，P-PFH-NPs）組，以雙蒸水作為對(duì)照組。

1.3 FPBS-PFH-NPs基本特性檢測 用光學(xué)顯微鏡及倒置熒光顯微鏡觀察其表面形態(tài)，Malvern激光儀測量其粒徑大小、表面平均電位，采用紫外分光光度法檢測Bi2S3及FPBS-PFH-NPs的吸收光譜。

1.4 體外細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn) 宮頸癌Hela細(xì)胞在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，培育24 h，實(shí)驗(yàn)分為靶向組和非靶向組，分別在各組加入100 μl經(jīng)DiI標(biāo)記的FPBS-PFH-NPs和NPBS-PFH-NPs。孵育2 h，加入DiO（1 mg/ml）對(duì)Hela細(xì)胞染色，孵育20 min后，棄DiO，PBS沖洗2～3次，在激光共聚焦顯微鏡（×400）下觀察FPBS-PFH-NPs、NPBS-PFH-NPs組與Hela細(xì)胞結(jié)合情況。用上述同樣的方法觀察FPBSPFH-NPs和NPBS-PFH-NPs與正常人肝L02細(xì)胞的結(jié)合情況。

1.5 體外熱致相變實(shí)驗(yàn) 吸取一滴稀釋后的 FPBSPFH-NPs置于載玻片上，將載玻片置于倒置熒光顯微鏡配套的電加熱板中調(diào)整光鏡聚焦后逐漸升溫加熱板，觀察納米粒的大小及形態(tài)變化。

1.6 體外聲致相變及超聲顯像實(shí)驗(yàn) 取5 ml雙蒸水稀釋的FPBS-PFH-NPs裝入EP管中，固定于高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）治療儀中，再用不同聲功率60 W、90 W、120 W、150 W、180 W HIFU輻照，時(shí)間2 s，以脫氣水為對(duì)照，采集FPBS-PFH-NPs相變前后二維及造影模式超聲圖像，用DFY定量分析儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制）測量其回聲強(qiáng)度變化。

1.7 體外光致相變及光聲顯像 分別取適量雙蒸水、P-PFH-NPs、FPBS-PFH-NPs溶液注入空洞凝膠模型中，置于光聲成像儀平臺(tái)上，以一定波長激光輻照各組樣品2 min，記錄各組激光輻照前后的二維及造影模式超聲圖像和光聲圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較FPBS-PFH-NPs與雙蒸水的回聲強(qiáng)度差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FPBS-PFH-NPs納米粒的基本特性 FPBS-PFHNPs呈圓形，形態(tài)規(guī)則，分布均一（圖1A）。倒置熒光顯微鏡觀察載DiI的FPBS-PFH-NPs散發(fā)紅色熒光（圖1B）。FPBS-PFH-NPs粒徑為（439.7±93.7）nm（圖1C），Zeta電位值為（-15.5±5.8）mV（圖1D）。紫外分光光度法測得FPBS-PFH-NPs與單純Bi2S3吸收光譜吸收峰相對(duì)應(yīng)，在近紅外光波長處均有廣泛的吸光能力（圖1E）。

圖1 FPBS-PFH-NPs基本性能檢測。A.光鏡下觀察FPBS-PFH-NPs；B.熒光顯微鏡下觀察DiI標(biāo)記的FPBS-PFH-NPs；C.FPBSPFH-NPs的粒徑；D.FPBS-PFH-NPs的電位；E.紫外分光光度法檢測FPBS-PFH-NPs與Bi2S3吸收光譜

2.2 體外細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn) 激光共聚焦顯微鏡下觀察葉酸靶向組 FPBS-PFH-NPs見大量紅色納米粒緊密地、特異性地結(jié)合在Hela細(xì)胞周圍，表明FPBS-PFHNPs有主動(dòng)靶向?qū)m頸癌Hela細(xì)胞的能力。而非靶向組NPBS-PFH-NPs未見明顯紅色納米粒與Hela細(xì)胞結(jié)合。而在負(fù)性細(xì)胞正常人肝L02細(xì)胞中，無論是靶向組還是非靶向組均未見納米粒與 L02細(xì)胞特異性結(jié)合（圖2）。

2.3 體外熱致相變 當(dāng)加熱板溫度為 60℃、64℃、66℃、68℃、70℃、73℃時(shí)，光鏡下FPBS-PFH-NPs的變化見圖3。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察體外尋靶結(jié)果，各組納米粒與細(xì)胞分別散發(fā)紅色和綠色熒光。A.非靶向組NPBS-PFH-NPs與Hela細(xì)胞未見明顯結(jié)合；B.葉酸靶向組FPBS-PFH-NPs大量結(jié)合在Hela細(xì)胞周圍；C.非靶向組NPBS-PFH-NPs與肝L02細(xì)胞未見明顯結(jié)合；D.葉酸靶向組FPBS-PFH-NPs與肝L02細(xì)胞未見明顯結(jié)合

圖3 FPBS-PFH-NPs熱致相變光鏡圖。A.60℃時(shí)FPBS-PFH-NPs未發(fā)生明顯變化；B.64℃開始出現(xiàn)微氣泡；C.66℃時(shí)微氣泡數(shù)量逐漸增多；D.68℃時(shí)微氣泡體積和數(shù)量繼續(xù)增加；E.70℃時(shí)部分微氣泡破裂，部分融合為更大的氣泡；F.73℃時(shí)更多微氣泡破裂

2.4 體外聲致相變及超聲成像 不同功率HIFU作用于FPBS-PFH-NPs后，超聲回聲強(qiáng)度較作用前增加，當(dāng)功率從60 W增加到180 W時(shí)，其回聲強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而雙蒸水組在高達(dá)180 W功率作用后的回聲強(qiáng)度無明顯變化，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

2.5 體外光致相變及超聲/光聲成像 激光輻照后，F(xiàn)PBS-PFH-NPs（圖5I～L）與P-PFH-NPs組（圖5E～H）二維、造影模式回聲強(qiáng)度高于雙蒸水組（圖5A～D），而雙蒸水組輻照前后未見明顯變化；而 FPBS-PFHNPs組（圖6E～F）光聲信號(hào)明顯高于P-PFH-NPs（圖6C、D）與雙蒸水組（圖6A、B），而后兩者輻照前后均無明顯變化。

圖4 聲致相變后的超聲成像。A、I.HIFU作用前雙蒸水的二維及造影模式；B、J.HIFU作用（180 W）后雙蒸水的二維及造影模式；C、K.HIFU作用前FPBS-PFH-NPs的二維及造影模式；D～H.HIFU作用后FPBS-PFH-NPs的二維模式，功率依次為60 W、90 W、120 W、150 W、180 W；L～P.HIFU作用后FPBS-PFH-NPs的造影模式，功率依次為60 W、90 W、120 W、150 W、180 W；Q.不同功率HIFU作用FPBS-PFH-NPs與雙蒸水組相變前后的回聲強(qiáng)度；與雙蒸水組比較，*P<0.05

圖5 激光輻照前后光致相變的二維及造影模式超聲成像。A、B.雙蒸水組輻照前；C、D.雙蒸水組輻照后；E、F.P-PFH-NPs組輻照前；G、H.P-PFH-NPs組輻照后；I、J.FPBS-PFH-NPs組輻照前；K、L.FPBS-PFH-NPs組輻照后，F(xiàn)PBS-PFH-NPs與P-PFHNPs組二維、造影模式回聲強(qiáng)度明顯高于雙蒸水組，而雙蒸水組無明顯變化

圖6 激光輻照前后的光聲成像。A、B.雙蒸水組，C、D.P-PFH-NPs組，E、F.FPBS-PFH-NPs組；FPBS-PFH-NPs組光聲成像信號(hào)明顯高于P-PFH-NPs與雙蒸水組，而后兩者輻照前后均無明顯變化

3 討論

目前研究的靶向分子探針具有抗原性、與靶點(diǎn)結(jié)合率低、產(chǎn)量低、制備繁瑣等缺點(diǎn)，因此，尋求一種制備簡單、靶向特異性及靈敏度高的靶向分子探針成為研究熱點(diǎn)[6]。葉酸分子具有質(zhì)量小、免疫原性低、易于修飾、高度特異性、達(dá)靶點(diǎn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)葉酸與高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合時(shí)，能夠開啟受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向策略，實(shí)現(xiàn)真正意義上的腫瘤細(xì)胞分子顯像及治療，是理想的靶向分子探針[7]。葉酸受體在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、鼻咽癌等多數(shù)上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，卻幾乎不表達(dá)于正常組織細(xì)胞表面，具有良好的腫瘤組織特異性[8]。本研究體外尋靶實(shí)驗(yàn)顯示，靶向組見大量FPBS-PFHNPs緊密結(jié)合在 Hela細(xì)胞周圍，而非靶向組未見NPBS-PFH-NPs與Hela細(xì)胞結(jié)合，表明FPBS-PFHNPs具有良好的主動(dòng)靶向?qū)m頸癌Hela細(xì)胞的能力。由于L02細(xì)胞是正常人肝臟細(xì)胞，幾乎不表達(dá)葉酸受體，故FPBS-PFH-NPs、NPBS-PFH-NPs與L02細(xì)胞作用后均未見明顯特異性結(jié)合，證實(shí)FPBS-PFH-NPs對(duì)靶標(biāo)的高度特異性。

FPBS-PFH-NPs的核心相變材料是PFH，沸點(diǎn)為56℃，室溫下呈液態(tài)，不容易氣化，具有良好的穩(wěn)定性及低毒性，其保存或制作乳劑相對(duì)容易。當(dāng)溫度升高超過沸點(diǎn)或外界壓力減小至氣化壓力閾值時(shí)，PFH能夠由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)，即液氣相變[9]，增強(qiáng)超聲成像效果。同時(shí)包裹的Bi2S3納米顆粒也能改變組織聲阻抗，協(xié)同增效背向散射能力，增強(qiáng)超聲顯影[10]。在體外相變實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)PBS-PFH-NPs隨著加熱板的升溫，核心PFH達(dá)到氣化閾值而發(fā)生液氣相變成微氣泡，當(dāng)升溫到一定程度時(shí)，微氣泡就會(huì)破裂，證明PFH被成功包裹入納米粒中并具有相變能力。當(dāng)一定能量的 HIFU輻照FPBS-PFH-NPs后，其超聲回聲強(qiáng)度較作用前明顯增加，隨著功率增大，其回聲強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而雙蒸水組在HIFU輻照前后均無明顯變化，其原因?yàn)镠IFU產(chǎn)生的熱效應(yīng)等促使PFH發(fā)生液氣相變，相變的納米粒協(xié)同增強(qiáng)HIFU的空化效應(yīng)，發(fā)生相變的FPBS-PFH-NPs數(shù)量增多，形成更多的微氣泡，氣泡與周圍環(huán)境聲阻抗的差異明顯更大，從而增強(qiáng)背向散射及超聲顯影。

光聲成像利用寬束短脈沖激光輻照生物組織，組織內(nèi)吸光子吸收光能后轉(zhuǎn)化為熱能，引起周圍介質(zhì)溫度升高，產(chǎn)生熱彈性膨脹，進(jìn)而散發(fā)出聲波信號(hào)，經(jīng)傳聲器及圖像處理系統(tǒng)接受并重建出光聲圖像，其光聲信號(hào)強(qiáng)弱與光源及生物組織中的吸光成分密切相關(guān)[4,11]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的FPBS-PFH-NPs在激光作用后檢測到明顯的光聲信號(hào)，而P-PFH-NPs與雙蒸水組均未見到明顯變化。由于FPBS-PFH-NPs成功包裹Bi2S3后在近紅外光作用下與單純Bi2S3吸收光譜接近，具有較強(qiáng)的光吸收屬性，能吸收近紅外波段的激光能量，對(duì)靶區(qū)組織行光聲成像，是良好的光聲成像顯像劑[12]。同時(shí)，激光輻照后，P-PFH-NPs和雙蒸水組均未見明顯變化，而FPBS-PFH-NPs組二維、造影模式超聲成像明顯增強(qiáng)，其原因可能是Bi2S3吸收激光能量轉(zhuǎn)化為熱能，使介質(zhì)溫度升高超過PFH沸點(diǎn)，發(fā)生液氣相變?yōu)槲馀荩鰪?qiáng)靶區(qū)超聲顯影，成功證明了FPBS-PFHNPs具備光致相變及光聲成像能力。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了葉酸靶向相變型超聲/光聲雙模態(tài)對(duì)比劑FPBS-PFH-NPs，具備良好的體外尋靶、相變及增強(qiáng)超聲/光聲顯像能力，是一種極具發(fā)展?jié)撃艿陌邢蛟\療多功能分子探針。