油茶籽餅粕中甲醇提取物抑制黃曲霉菌效果及成分分析

王亞萍，費(fèi)學(xué)謙，陸寬寬，姚小華，郭少海，王開(kāi)良

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油茶籽餅粕中甲醇提取物抑制黃曲霉菌效果及成分分析

王亞萍，費(fèi)學(xué)謙※，陸寬寬，姚小華，郭少海，王開(kāi)良

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，杭州 311400）

為了明確油茶籽餅粕中對(duì)黃曲霉菌有抑制作用的活性物質(zhì)。該研究開(kāi)展了油茶籽餅粕不同溶劑提取物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響研究。選用80%甲醇作為溶劑對(duì)油茶籽粕進(jìn)行提取，提取液依次利用乙酸乙酯、飽和正丁醇進(jìn)行梯度萃取，得到乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，正丁醇萃取相對(duì)黃曲霉菌有較好的抑制效果，100 mg/mL濃度效果最好，抑菌圈直徑為22.00 mm，菌絲干質(zhì)量相比對(duì)照減少了42.88%，黃曲霉毒素未被檢出，而乙酸乙酯萃取相和水相對(duì)黃曲霉菌的抑制效果較弱，甚至無(wú)抑菌效果。采用柱層析、超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)正丁醇萃取相中的抑菌物質(zhì)進(jìn)行純化鑒定，分離出了3種黃酮苷類(lèi)化合物：1）山奈酚-3--[-D-吡喃葡萄糖苷-(1→3)---L-吡喃鼠李糖-(1→6)---D-吡喃半乳糖苷]；2）山奈酚-3--[2---D-吡喃木糖基-6---L-吡喃鼠李糖]--D-吡喃葡萄糖苷；3）山奈酚-3--(6-反式-對(duì)-香豆酰基）--D-吡喃葡萄糖基-(1→3)---L-吡喃鼠李糖-(1→6)---D-吡喃半乳糖苷。以上研究結(jié)果為黃曲霉菌天然抑菌劑的研究和開(kāi)發(fā)提供了參考，也拓寬了油茶副產(chǎn)物的加工利用途徑。

種子；萃取物；活性組分；抑制；黃曲霉

0 引 言

油茶（Abel.）是山茶科山茶屬植物，是世界四大木本油料樹(shù)種之一[1]。油茶籽油是中國(guó)獨(dú)有的極具營(yíng)養(yǎng)、健康及經(jīng)濟(jì)、社會(huì)價(jià)值的特色油脂資源，其不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，還含有蛋白質(zhì)、多糖、皂苷、酚類(lèi)、VE、甾醇、角鯊烯等多種功能性成分[2]，在各項(xiàng)主要指標(biāo)上接近甚至超過(guò)橄欖油，能充分平衡人體營(yíng)養(yǎng)，有利身體健康[3]。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的不斷增強(qiáng)，油茶籽油日益受到消費(fèi)者的青睞，油茶籽的開(kāi)發(fā)利用日益受到重視，隨之而來(lái)的副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用也逐漸被重視起來(lái)，但在質(zhì)量控制方面仍存在不少問(wèn)題，油茶籽在采收、貯存、加工及運(yùn)輸過(guò)程中存在著被有毒有害物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)，如苯并芘、黃曲霉毒素等[4]。

黃曲霉菌（）是一種是常見(jiàn)的腐生真菌，易侵染花生、玉米和堅(jiān)果等糧食經(jīng)濟(jì)作物，可以產(chǎn)生黃曲霉毒素（aflatoxins，簡(jiǎn)稱(chēng)AFs）[5]，低劑量的黃曲霉毒素對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，會(huì)增加肝癌的發(fā)生率，高劑量的黃曲霉毒素可導(dǎo)致劇毒而致死[6]。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ι類(lèi)致癌物，可使人類(lèi)和多種動(dòng)物誘發(fā)原發(fā)性肝細(xì)胞癌，是目前已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物[7-9]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）研究，世界范圍內(nèi)1/4的糧食作物受到真菌毒素的污染，且主要是受黃曲霉毒素的污染。它主要來(lái)自受污染的糧油及其制品如花生、花生油、玉米、大米、面粉、堅(jiān)果、棉籽、牛奶等[10]。如何有效地防止黃曲霉污染已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的重大問(wèn)題。

長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)黃曲霉菌及毒素的研究還主要集中在檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化和毒素的脫除[11-13]。目前，植物和微生物源活性物質(zhì)對(duì)黃曲霉和黃曲霉毒素的防治越來(lái)越受到人們的重視[14]。筆者前期研究表明，油茶籽不易感染黃曲霉菌，僅在高溫、高濕環(huán)境或黃曲霉孢子大量存在條件下會(huì)被黃曲霉菌侵染，但其侵染和產(chǎn)毒量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于花生、玉米等易感染黃曲霉菌的油料，而且在人為接種黃曲霉菌后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，黃曲霉毒素含量呈下降趨勢(shì)[15]。由此推斷可能由于油茶籽中含有某些能夠抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的天然拮抗物質(zhì)。但其中哪種物質(zhì)對(duì)黃曲霉產(chǎn)生拮抗作用仍未見(jiàn)研究，對(duì)此，本研究開(kāi)展了油茶籽餅粕不同溶劑萃取物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的抑制效果，篩選出抑菌物質(zhì)類(lèi)型，并進(jìn)一步分離純化鑒定出抑菌活性成分。以期為黃曲霉菌天然抗菌劑的研發(fā)提供參考和指導(dǎo)，同時(shí)也有利于拓寬油茶副產(chǎn)物的加工利用途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油茶籽：采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所的油茶種植基地。成熟油茶籽采收后于60 ℃烘干至含水率約7%[16]，液壓榨油后對(duì)茶餅進(jìn)行干燥、粉碎，索氏抽提除去殘余油脂，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

產(chǎn)毒黃曲霉菌種：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心（CGMCC No. 3.06305）。

PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。其他測(cè)定用試劑均為分析純，檢測(cè)黃曲霉毒素和活性物質(zhì)鑒定所用試劑均為色譜純。AFs混合標(biāo)樣購(gòu)自上海安譜公司。

1.2 儀器設(shè)備

6YY-190液壓榨油機(jī)（河南省洛陽(yáng)市汝陽(yáng)液壓機(jī)械廠），DKS-12水浴鍋（嘉興中新醫(yī)療儀器有限公司），B-811索氏抽提器（瑞士Buch公司），BSC-1000ⅡA2生物安全柜（蘇州蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）；SHP-450生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LDZF-30KB立式蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DM-4B生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；BS-1F全溫度振蕩培養(yǎng)搖床（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）；Eppendorf mini Span離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國(guó)Agilent科技公司）；UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)：AcquityTMultra型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），Triple TOF 5600+型飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)AB Sciex公司）。

1.3 黃曲霉孢子懸液的制備

用無(wú)菌吸管吸取0.4 mL無(wú)菌水，滴入干粉安瓿瓶?jī)?nèi)輕輕震蕩，使黃曲霉菌粉末呈懸浮狀態(tài)，吸取0.2 mL菌液移植于PDA斜面。于29 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，再轉(zhuǎn)管一次，得到活化的黃曲霉菌種，培養(yǎng)5 d后，用含有0.1%吐溫80的無(wú)菌水將孢子從PDA斜面洗下，采用梯度稀釋法[17]，利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸浮液濃度為1.0×106孢子/mL，菌懸液要現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 油茶籽粕不同溶劑萃取物的制備

100 g脫脂的油茶籽粕加入1 000 mL 80%甲醇（體積比80:20），在60 ℃回流提取2 h，傾出提取液，再加入250 mL 80%甲醇，60 ℃提取1.5 h，將2次所得提取液合并，減壓濃縮除去甲醇溶劑，水相部分依次用乙酸乙酯、飽和正丁醇進(jìn)行梯度萃取，收集乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，分別減壓濃縮后于40 ℃真空干燥，于4 ℃冷藏備用。

1.5 不同溶劑萃取相的抑菌效果

乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分別稱(chēng)質(zhì)量1 g溶解于10 mL無(wú)菌水，配成100 mg/mL的溶液，再依次稀釋成50、33.5、25 mg/mL，用0.22m醋酸纖維膜過(guò)濾[18]備用。

1.5.1 抑菌圈法

采用改良的牛津杯法[19]。用無(wú)菌吸管吸取100L黃曲霉孢子懸液（1.0×106孢子/mL）到PDA平板表面，涂布均勻。取3個(gè)內(nèi)徑6 mm的牛津杯輕置于平板表面。每個(gè)杯體內(nèi)加入200L不同濃度的乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，靜置15 min，用封口膜固定培養(yǎng)皿，于4 ℃放置12 h使提取液充分?jǐn)U散，取出后置于29 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后測(cè)量抑菌圈直徑，每處理重復(fù)3次，以無(wú)菌水作對(duì)照。

1.5.2 菌絲干質(zhì)量法

吸取200L的1×106/mL孢子菌懸液，加入裝有20 mL已滅菌的PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，加入1%吐溫80使黃曲霉孢子均勻分散，再分別添加200L不同濃度的乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，使最終濃度分別為100、50、33.5、25 mg/mL，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)重復(fù)，于29 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d后取出，用濾紙過(guò)濾，挑出菌絲于45 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)量、計(jì)算菌絲干質(zhì)量。保留濾液，用于測(cè)定黃曲霉毒素[20]。

1.5.3 黃曲霉毒素含量測(cè)定

1.5.2所得濾液經(jīng)酶聯(lián)免疫親和柱凈化處理后測(cè)定黃曲霉毒素，測(cè)定方法參考GB 5009.22-2016（第一法）。液相色譜條件：Symmetry C18柱（150 mm×3.9 mm，5m）。流動(dòng)相A：0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸銨, 流動(dòng)相B：乙腈；柱溫：35 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10L；梯度洗脫：0 min，50%B；2 min 60% B；6～7 min，100% B；10～12 min，50% B。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI+）；毛細(xì)管壓力：3.0 kV；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM。

1.6 正丁醇萃取相分離純化和抑菌效果

采用柱色譜法。稱(chēng)取15 g正丁醇萃取物，加入50 mL蒸餾水，充分溶解后經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂柱層析，依次用2倍柱體積的乙醇水洗脫體系（蒸餾水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇）洗脫，流速為20 mL/min，分別收集各部分洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥得到5種洗脫物。

分別稱(chēng)質(zhì)量1 g上述5種洗脫物溶解于10 mL無(wú)菌水中，配成100 mg/mL的溶液，再依次用無(wú)菌水稀釋成50和25 mg/mL，用0.22m醋酸纖維膜過(guò)濾[18]。采用抑菌圈法和菌絲干質(zhì)量法，再測(cè)定黃曲霉毒素含量，具體方法同1.5.1、1.5.2和1.5.3。

1.7 活體上的驗(yàn)證試驗(yàn)

用75%乙醇對(duì)玉米和花生籽粒進(jìn)行表面消毒，粉碎成較大顆粒，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)含水量至20%以上，裝入培養(yǎng)皿，接種1 mL黃曲霉孢子懸液（1.0×106mL），再加入100 mg/mL75%乙醇洗脫物，混勻，以等量的無(wú)菌水作為對(duì)照，每隔24 h檢測(cè)黃曲霉菌的生長(zhǎng)情況，5 d后測(cè)定黃曲霉毒素含量。

1.8 75%乙醇洗脫物中的活性物質(zhì)鑒定

將75%乙醇洗脫物用50%甲醇（體積比）溶解配制成濃度5 mg/mL，于10 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)。液相條件：流動(dòng)相A：0.1%（體積比）甲酸-水溶液，流動(dòng)相B：0.1%（體積比）甲酸乙腈；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；色譜柱為ZORBAX-SBC18（100 mm×4.6 mm（i.d.），1.8m，安捷倫公司）；進(jìn)樣量5L；柱溫30 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-），掃描范圍/100～1 500；霧化氣（GS1）50 psi；霧化氣（GS2）50 psi；氣簾氣（CUR）35 psi；離子源溫度550 ℃；離子源電壓（IS）：?4 500 V。檢索譜庫(kù)：Scifinder、Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，用檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢測(cè)，<0.05，認(rèn)為存在顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽粕不同溶劑萃取相的抑菌效果

2.1.1 對(duì)抑菌圈直徑的影響

本研究采用80%甲醇、乙酸乙酯、正丁醇依次對(duì)油茶籽粕進(jìn)行梯度萃取，每種溶劑的萃取得率有所不同（表1），乙酸乙酯相得率最低，僅2.44%，其次是水相，得率為16.61%，正丁醇的極性最大，其萃取得率最高，為30.25%。

表1 油茶籽粕不同溶劑萃取相的得率和抑菌效果（抑菌圈直徑）

注：ND為無(wú)抑菌圈，下同。

Note: ND is not detectable, the same below.

3種萃取相（乙酸乙酯相、正丁醇相和水相）對(duì)黃曲霉菌表現(xiàn)出不同的抑制活性（表1）。正丁醇相對(duì)黃曲霉菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，且隨濃度增大，抑菌效果增強(qiáng)，抑菌圈由25 mg/mL時(shí)的15.25 mm增大到100 mg/mL時(shí)的22.00 mm。相比之下，水相對(duì)黃曲霉的抑菌效果較弱，僅在高濃度（100 mg/mL）時(shí)有抑菌效果，抑菌圈直徑僅為12.90 mm。乙酸乙酯相對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)無(wú)抑菌效果，各濃度均無(wú)抑菌圈出現(xiàn)。

2.1.2 對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響

圖1可見(jiàn)，乙酸乙酯相和水相對(duì)黃曲霉菌的菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯的抑制效果，相反地，水相在濃度較低（25、33.5 mg/mL）時(shí)會(huì)促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)。相比之下，正丁醇相明顯抑制了黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)，菌絲干質(zhì)量顯著低于乙酸乙酯相和水相（<0.01），且隨著濃度增大菌絲干質(zhì)量明顯減少，從25 mg/mL時(shí)的0.16 g減少到了100 mg/mL時(shí)的0.12 g，比對(duì)照減少了42.88%，可見(jiàn)，正丁醇萃取相濃度越大，對(duì)菌絲的抑制效果越好。

圖1 油茶籽粕不同溶劑萃取相對(duì)黃曲霉菌絲干質(zhì)量的影響

2.1.3 對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響

液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），所有樣品（乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和對(duì)照）的PDB培養(yǎng)液中均未檢出AFB2，添加乙酸乙酯相和水相的PDB培養(yǎng)液檢出了AFB1，而在正丁醇相的處理中未檢出AFB1，可見(jiàn)，正丁醇萃取物能有效抑制AFB1的產(chǎn)生。

表2 油茶籽粕不同溶劑萃取相對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響

注：不同小寫(xiě)字母表示在0.05 水平上差異顯著，下同。

Note: Lower letters are significantly different on the0.05 level, the same below.

AFB1含量和菌絲生長(zhǎng)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，AFB1含量和抑菌圈直徑呈顯著負(fù)相關(guān)（=?0.937 6，=0.002 1），與菌絲干質(zhì)量呈顯著正相關(guān)（=0.581 0，=0.005 8）?？梢?jiàn)，油茶籽粕80%甲醇提取物的正丁醇萃取相能有效抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)和AFB1產(chǎn)生。

2.1.4 抑菌物質(zhì)的初步確定

對(duì)正丁醇和乙酸乙酯兩種溶劑進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），二者對(duì)黃曲霉菌無(wú)明顯的抑制效果，由此可以排除正丁醇和乙酸乙酯這2種溶劑本身對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)油茶籽粕正丁醇提取物中的主要化學(xué)成分是茶皂素[21-22]，對(duì)油茶籽中提取的茶皂素的抑菌結(jié)果見(jiàn)表3，茶皂素對(duì)黃曲霉菌無(wú)抑制效果。由此推測(cè)對(duì)黃曲霉菌起抑制作用的是正丁醇萃取物中的其他活性成分，有必要進(jìn)一步對(duì)正丁醇萃取相進(jìn)行純化和鑒定。

表3 正丁醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取相和茶皂素的抑菌效果對(duì)比

2.2 正丁醇萃取相梯度洗脫物的抑菌效果

2.2.1 對(duì)抑菌圈直徑的影響

由表4可見(jiàn)，正丁醇相的各洗脫物中，75%乙醇洗脫物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，在50和100 mg/mL時(shí)抑菌圈直徑分別為146.6和163.7 mm，且二者呈極顯著差異（<0.01），在25 mg/mL時(shí)未出現(xiàn)抑菌圈，可見(jiàn)其最小抑菌濃度為50 mg/mL。其余各洗脫物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)均無(wú)抑菌效果，未出現(xiàn)抑菌圈。

表4 正丁醇萃取相各洗脫物對(duì)黃曲霉菌的抑制效果

2.2.2 對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響

液體培養(yǎng)過(guò)濾后菌絲質(zhì)量結(jié)果顯示（圖2），與對(duì)照相比，水洗脫物對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制作用甚至?xí)龠M(jìn)生長(zhǎng)，25%乙醇洗脫物和50%乙醇洗脫物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)有少量的抑制作用但效果不顯著（>0.05），100%乙醇洗脫物基本無(wú)抑制作用；75%乙醇洗脫物對(duì)黃曲霉菌的菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用（<0.01），且濃度越大，菌絲生長(zhǎng)量越低，這一結(jié)果與固體培養(yǎng)結(jié)果一致。

2.2.3 對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響

表5可見(jiàn)，所有樣品均未檢測(cè)出AFB2，添加不同濃度的水洗脫物和25%乙醇洗脫物的PDB培養(yǎng)液中均含有AFB1，且含量較高，可見(jiàn)，水洗脫物和25%洗脫物對(duì)AFB1的產(chǎn)生無(wú)明顯的抑制作用；50%乙醇洗脫物在25 mg/mL濃度時(shí)AFB1含量與對(duì)照相比有所下降，但未能完全抑制產(chǎn)毒，當(dāng)濃度升高時(shí)才能完全抑制產(chǎn)毒；75%乙醇洗脫物對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒能力的抑制效果較明顯，各濃度處理均未檢出AFB1；100%乙醇洗脫物僅在高濃度（100 mg/mL）時(shí)能完全抑制AFB1的產(chǎn)生。

圖2 正丁醇萃取相各洗脫物對(duì)黃曲霉菌菌絲干質(zhì)量的影響

表5 正丁醇萃取相各洗脫物中黃曲霉毒素含量

綜上分析表明，油茶籽餅粕梯度萃取的正丁醇萃取相各洗脫物中，75%乙醇洗脫物能夠顯著抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也能有效抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。

2.2.4 活體驗(yàn)證試驗(yàn)

由活體驗(yàn)證試驗(yàn)可見(jiàn)，培養(yǎng)24 h時(shí)各處理及對(duì)照均有少量的黃曲霉菌生長(zhǎng)，肉眼觀察無(wú)明顯區(qū)別，隨后對(duì)照的黃曲霉菌生長(zhǎng)明顯加快，至48 h后玉米和花生表面均覆蓋了一層白色菌絲，籽粒間開(kāi)始出現(xiàn)黏連，而添加75%乙醇洗脫物后黃曲霉菌生長(zhǎng)明顯減緩，玉米和花生籽粒清晰可見(jiàn)（圖3），此后處理與對(duì)照的區(qū)別更加明顯，至72 h時(shí)對(duì)照樣品上覆著一層較厚的菌絲膜，玉米和花生籽粒被菌絲黏連成塊狀，而75%乙醇洗脫物處理的樣品籽粒仍為獨(dú)立分開(kāi)，僅在單個(gè)顆粒上出現(xiàn)少量菌絲。由此可見(jiàn)，75%乙醇洗脫物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。5 d后對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6，與對(duì)照相比，加入75%乙醇洗脫物后，玉米和花生中的AFB1含量呈現(xiàn)極顯著的下降水平（<0.01）。以上結(jié)果有力驗(yàn)證了75%乙醇洗脫物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的抑制作用。

圖3 75%乙醇洗脫物對(duì)玉米、花生中黃曲霉菌生長(zhǎng)的影響（48 h）

表6 75%乙醇洗脫物對(duì)玉米、花生中黃曲霉產(chǎn)毒的影響（5 d）

2.3 抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)75%乙醇洗脫物進(jìn)行負(fù)離子模式分析，得到紫外色譜圖（圖4）。根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合可能的分子式，通過(guò)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜信息，推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)，分析鑒定出3種化合物。

化合物1：該化合物的出峰時(shí)間為9.822，[M-H]-為755.204 8，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C33H40O20，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜，化合物母核質(zhì)荷比為285，結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)6碳糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)該化合物為山奈酚-3--[-D-吡喃葡萄糖苷-(1→3)---L-吡喃鼠李糖-(1→6)---D-吡喃半乳糖苷]（kaempferol-3--[-D-glucopyranosyl-(1→3)----rhamnopyranosyl-(1→6)---D-galactopyranoside] ）。

化合物2：該化合物的出峰時(shí)間為10.61，[M-H]-為725.1940，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C32H38O19，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜，化合物母核質(zhì)荷比為285，結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)5碳糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和推測(cè)該化合物為山奈酚-3--[2---D-吡喃木糖基-6---L-吡喃鼠李糖]--D-吡喃葡萄糖苷（kaemferol-3--[2---D-xylopyranosyl-6----rhamnopyranosyl]--D-glucopyranoside）。

化合物3：該化合物的出峰時(shí)間為15.26，[M-H]-為901.2427，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C42H46O22，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜，化合物母核質(zhì)荷比為285，比化合物1多一個(gè)多羥基香豆酸結(jié)構(gòu)，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和推測(cè)該化合物為山奈酚-3--(6-反式-對(duì)-香豆?；?-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)---L-吡喃鼠李糖-(1→6)---D-吡喃半乳糖苷（kaempferol-3--[6-trans-p-coumaroyl)-D-glucopyranosyl-(1→3)---L-rhamnopyranosyl-(1→6)---D-galactopyranoside]）。

圖4 75%乙醇洗脫物紫外（320 nm）色譜圖

表7 75%乙醇洗脫物中化合物的UPLC-Q-TOF/MS分析參數(shù)

3 討 論

植物材料中活性成分的成功預(yù)測(cè)在很大程度上取決于提取過(guò)程中所用溶劑的種類(lèi)，傳統(tǒng)上許多活性成分是用水作為溶劑進(jìn)行提取的，但甲醇和乙醇提取物顯示出更強(qiáng)的效果[23]，大多數(shù)活性成分在有機(jī)溶劑中的溶解度要優(yōu)于非有機(jī)溶劑[24]。本研究采用甲醇提取脫脂油茶籽餅，這是由于抑菌活性成分在80%甲醇溶劑中有更好的溶解性，而這些成分在水和其他溶劑中的不能被充分溶解[25]。

由于植物中的化學(xué)成分極其復(fù)雜，在提取活性成分時(shí)，僅用某一種溶劑有時(shí)候不可能將植物的活性組分都提取出來(lái)，因此有必要采用極性不同的幾種溶劑對(duì)同一植物進(jìn)行提取，使得各成分依其在不同溶劑中的溶解度差異而分離出來(lái)，從而避免最強(qiáng)活性物質(zhì)的漏篩。本研究采用80%甲醇、乙酸乙酯、正丁醇依次對(duì)油茶籽粕進(jìn)行梯度萃取，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇和正丁醇萃取物的抑菌效果具有明顯的劑量依賴效應(yīng)，即濃度越大，抑菌效果越好，這一發(fā)現(xiàn)與前人的研究結(jié)果一致[26-27]。不同萃取相中，正丁醇的提取效率最高，萃取物抑菌效果最好，可見(jiàn)其中包含了更多的活性物質(zhì)，有效干擾和破壞了黃曲霉菌菌絲的正常生長(zhǎng)，這可能是由于正丁醇萃取物使得黃曲霉的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到損傷，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，菌絲衰敗，從而導(dǎo)致了菌絲質(zhì)量顯著減少[28]。

自然界產(chǎn)生的黃曲霉毒素主要包括AFB1、AFG1、AFB2和AFG2（按照毒性由高到低的順序），黃曲霉菌可產(chǎn)生B類(lèi)毒素，寄生曲霉菌可產(chǎn)生B類(lèi)和G類(lèi)毒素[29]。其中AFB1最常被檢出，也是目前已知致癌性最強(qiáng)的天然毒素，AFM1、AFG1次之，AFB2、AFG2較弱[30,11]。在本研究中，所有樣品均未檢出AFB2，僅有AFB1被檢出，這與之前的研究結(jié)果一致[15]。AFB1是目前已知最強(qiáng)的致癌性化學(xué)物之一，被FAO和WHO列為I級(jí)致癌物，是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要因素之一。

適于真菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸膏蔗糖培養(yǎng)基等，黃曲霉毒素的產(chǎn)生需要一定的條件，影響黃曲霉毒素合成的因素很多，如菌種、碳源、溫度、空氣、濕度等因素[31]。馬群飛[32]、莊振宏[33]等對(duì)不同培養(yǎng)基對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，與其他培養(yǎng)基質(zhì)相比，大米培養(yǎng)基更有利于AFB1的產(chǎn)生。也有研究認(rèn)為，YES培養(yǎng)基可以較好地誘導(dǎo)黃曲霉菌的產(chǎn)毒[34-35]。本研究中使用的培養(yǎng)基為PDA和PDB培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果顯示AFB1的產(chǎn)量普遍偏低，分析其原因可能與所選擇使用的培養(yǎng)基種類(lèi)有關(guān)，也有可能是所選用的黃曲霉菌種本身的產(chǎn)毒能力偏低。

油茶籽粕正丁醇提取物中的主要化學(xué)成分是茶皂素[21-22]。茶皂素除具有發(fā)泡、乳化、去污、洗滌等用途外，還具有多種生理活性和生理功能，對(duì)一些病原菌有較好的抑制效果，如酵母（），黑曲霉（），青霉（），大腸桿菌（），產(chǎn)朊假絲酵母（），蕈狀芽孢桿菌（），白色念珠菌（）和枯草芽孢桿菌（）[36-42]。然而，茶皂素對(duì)于黃曲霉菌抑制作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究中正丁醇萃取物對(duì)黃曲霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒有明顯的拮抗效果，而茶皂素對(duì)黃曲霉菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制效果，可見(jiàn)油茶籽粕正丁醇萃取物中對(duì)黃曲霉菌起抑制作用的不是茶皂素，而是茶皂素以外的其他活性成分。這為開(kāi)發(fā)為可以廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的植物源抑菌劑提供了良好的理論基礎(chǔ)，也為油茶籽餅粕的開(kāi)發(fā)利用提供了更好的途徑，提高了油茶副產(chǎn)物利用水平。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，油茶籽餅80%甲醇提取液的正丁醇萃取物對(duì)黃曲霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒有明顯的拮抗效果，且隨濃度增大抑菌效果增強(qiáng)，100 mg/mL時(shí)抑菌圈直徑達(dá)22.00 mm，菌絲干質(zhì)量相比對(duì)照減少了42.88%，黃曲霉毒素未被檢出。對(duì)正丁醇萃取物進(jìn)一步純化鑒定，確定抑菌活性成分為3種黃酮苷類(lèi)化合物：山奈酚-3--[-D-吡喃葡萄糖苷-(1→3)---L-吡喃鼠李糖-(1→6)---D-吡喃半乳糖苷]，山奈酚-3--[2---D-吡喃木糖基-6---L-吡喃鼠李糖]--D-吡喃葡萄糖苷，山奈酚-3--(6-反式-對(duì)-香豆?；?-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)---L-吡喃鼠李糖-(1→6)---D-吡喃半乳糖苷。

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Inhibitory effect ofand component analysis of methanol extraction from camellia seed cake

Wang Yaping, Fei Xueqian※, Lu Kuankuan, Yao Xiaohua, Guo Shaohai, Wang Kailiang

((),311400,)

() is a well-known diffused fungus that contaminates a great number of crops used for human and animal consumption. How to effectively prevent the contamination becomes a significant problem. Camellia (Abel.) is one of the four dominant, woody, oil species in the world. Oil from camellia seeds is rich in essential fatty acids and vitamins. This oil can alleviate malnutrition by balancing human nutrition to benefit human health, and it conforms to the consumption trends of modern edible oils, along with the utilization of its by-products is getting more and more attention. In recent years, the prevention and treatment ofand AFs by plant sources and active microbial substances have attracted more attention. Our previous study shows that camellia seed cake is not susceptible to. Based on the result, we propose that there may be a certain natural antagonistic substances that can inhibit the growth ofand the production of AFs in camellia seeds. This study was designed to evaluate the antifungal effect of the active substance in camellia seed cake on the growthand toxigenicity throughandantifungal tests, to make a determination of antimicrobial substances contained in the camellia seed cake. Camellia seed cake was extracted by eighty percent methanol (v/v), the filtrate was extracted with ethyl acetate and saturated-butanol. Among the extracts, the-butanol phase exhibited apparent inhibition activity on the growth and aflatoxin production ofThe concentration of 100 mg/mL worked best, because the inhibitory zone diameter was 22.00 mm, the mycelial dry weight was 42.88% less than the control, both of the two indicators were significantly better than other treatments (<0.01), and no AFs were detected. Whereas the aqueous phase and ethyl acetate phase exhibited weak antifungal activity and no activity, respectively. In addition, the-butanol phase inhibited the production of aflatoxin B1(AFB1) ofeffectively, AFB1was not detected in all concentration treatments. The main chemical component of-butanol extract phase of eighty percent methanol extract in camellia seed cake was tea saponin, the research showed that tea saponin had no inhibitory effect on. Therefore, it was speculated that the other active component (s) in the-butanol extract phase had inhibitory effect on.-Butanol extract phase was separated and purified by means of AB-8 macroporous absorbent column chromatography, among the macroporous resin fraction of 0%, 25%, 50%, 75%, and 100% ethanol (v/v), the 75% ethanol fraction showed the highest antifungal activity, the concentration of 100 mg/mL worked best, because the inhibitory zone diameter was 163.7 mm, the mycelial dry weight was significantly lower than the control, both of the two indices were significantly superior to other treatments (<0.01), and AFs were undetected. The 75% ethanol fraction was assayed by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-fight mass spectrometry (UPLC-Triple-TOF/MS). The three compounds were identified which were 1) kaempferol-3--[-D-glucopyranosyl-(1→3)---L-rhamnopyranosyl-(1→6)---D-galactopyranoside]; 2) kaemferol-3-- [2---D-xylopyranosyl-6---L-rhamnopyranosyl]--D-glucopyranoside; and 3) kaempferol-3--[6-trans-p-coumaroyl)--D-glucopyranosyl-(1→3)---L-rhamnopyranosyl-(1→6)---D-galactopyranoside]. This study provides a reference and a guide for research and development of an antifungal agent for, and meanwhile broadens utilization of the by-products of camellia seed.

seeds; extraction; active compound; inhibition;

2019-01-10

2019-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31400577）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（CAFYBB2014QB036）

王亞萍，助理研究員，主要從事經(jīng)濟(jì)林采后處理及質(zhì)量控制研究。Email：wypeasy@163.com

費(fèi)學(xué)謙，研究員，主要從事經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品加工利用研究。Email：fxq6565@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.11.037

S789.7

A

1002-6819(2019)-11-0322-08

王亞萍，費(fèi)學(xué)謙，陸寬寬，姚小華，郭少海，王開(kāi)良. 油茶籽餅粕中甲醇提取物抑制黃曲霉菌效果及成分分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(11)：322－329. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.11.037 http://www.tcsae.org

Wang Yaping, Fei Xueqian, Lu Kuankuan, Yao Xiaohua, Guo Shaohai, Wang Kailiang. Inhibitory effect ofand component analysis of methanol extraction from camellia seed cake[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(11): 322－329. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.11.037 http://www.tcsae.org