不同收獲指數(shù)甘藍型油菜β-淀粉酶活性及其基因家族成員的表達分析

靳舒榮 王艷玫 常 悅 王月華 李加納 倪 郁,*

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不同收獲指數(shù)甘藍型油菜β-淀粉酶活性及其基因家族成員的表達分析

靳舒榮1,2, **王艷玫1,2,**常 悅1,2王月華1,2李加納1,2倪 郁1,2,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715

油菜“源”器官中光合產(chǎn)物向籽粒轉(zhuǎn)移的效率是提高油菜收獲指數(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 而“源”器官中淀粉酶活性影響同化物向籽粒的運輸強度。β-淀粉酶(β-amylase, BAM)及其基因家族成員與油菜高收獲指數(shù)形成之間的關(guān)系還不清楚。本研究選擇高產(chǎn)高收獲指數(shù)型、高產(chǎn)低收獲指數(shù)型、低產(chǎn)低收獲指數(shù)型3類油菜品種, 在終花期后5、10、15、20、25 d分別取莖桿、葉片、角果皮與種子, 分析β-淀粉酶活性及其基因家族成員的表達水平。結(jié)果表明, β-淀粉酶活性在所檢測“源”器官中酶活性總體隨發(fā)育時期增加。高收獲指數(shù)型油菜葉片、角果皮中的β-淀粉酶活性顯著高于低收獲指數(shù)型油菜。β-淀粉酶基因家族中,、與在油菜莖、葉及角果皮中的表達量總體隨發(fā)育時期增加。花后25 d時,與在高收獲指數(shù)油菜葉片、角果皮中的表達量顯著高于低收獲指數(shù)油菜。與在高收獲指數(shù)油菜角果皮中的表達量分別于花后15 d與20 d開始顯著高于低收獲指數(shù)油菜。綜合分析認(rèn)為,和可能通過促進葉片與角果皮淀粉分解而加強光合產(chǎn)物向籽粒的運輸強度;與可能主要通過作用于角果皮淀粉分解而調(diào)控光合產(chǎn)物向籽粒的運輸。與也可能參與了油菜種子中淀粉的調(diào)控。

甘藍型油菜; 收獲指數(shù); β-淀粉酶; 基因表達

油菜是我國主要的油料作物。隨著我國食用植物油的進口依存度日益增大, 提高油菜產(chǎn)量在很長一段時間內(nèi)將是油菜育種的主要目標(biāo)。作物生物產(chǎn)量主要來自光合產(chǎn)物積累, 其決定因素是光合效率, 而包括油菜在內(nèi)的以種子為收獲物的作物經(jīng)濟產(chǎn)量不但決定于光合效率, 還決定于光合產(chǎn)物的運輸與分配。收獲指數(shù)是指作物收獲時經(jīng)濟產(chǎn)量與生物產(chǎn)量的比值, 反映了光合產(chǎn)物的有效分配程度。植物綠色組織內(nèi)光合產(chǎn)物的主要暫貯形式是淀粉, 而蔗糖及其衍生物是光合產(chǎn)物向籽實等庫器官運輸?shù)闹饕问?。與其他作物相比, 油菜的生物產(chǎn)量不低, 但收獲指數(shù)卻顯著偏低[1], 因此, 如何調(diào)控油菜體內(nèi)淀粉與蔗糖的合成, 促進光合產(chǎn)物向籽粒轉(zhuǎn)移是提高油菜收獲指數(shù)、實現(xiàn)油菜高產(chǎn)的有效途徑。

甘藍型油菜角果皮內(nèi)淀粉酶活性的增高能促進淀粉向可溶性糖轉(zhuǎn)變, 提高光合產(chǎn)物向籽粒的運輸強度, 從而有助于提高油菜的收獲指數(shù)[2-3]。淀粉酶根據(jù)淀粉水解產(chǎn)物異頭碳的構(gòu)型可被分為α-淀粉酶與β-淀粉酶。這2種酶在油菜高收獲指數(shù)形成中各自的貢獻還沒有報道。a-淀粉酶是一種內(nèi)水解酶, 可降解葡聚糖以產(chǎn)生各種線性和分支的麥芽低聚糖, 包括a-麥芽糖。擬南芥3種α-淀粉酶基因的突變均不影響正常生長條件下淀粉的分解[4], 暗示了a-淀粉酶途徑不可能是淀粉分解的主要途徑。β-淀粉酶(β-amylase, BAM)是一種外水解酶, 它作用于a-1,4-連接的葡聚糖鏈的非還原端, 以產(chǎn)生β-麥芽糖。目前的實驗證據(jù)表明, 在淀粉分解過程中, β-淀粉酶途徑是淀粉分解產(chǎn)生麥芽糖的主要途徑[5]。馬鈴薯葉綠體靶向β-淀粉酶基因沉默時, 葉片淀粉水平升高[6]。β-淀粉酶是多基因家族, 其基因成員在植物淀粉降解和基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[7]。BAM以及各基因成員在油菜高收獲指數(shù)形成中的作用還不清楚。本研究選擇3種不同類型油菜品種, 調(diào)查終花期至青角中期主要“源”器官和種子中β-淀粉酶活性以及各基因家族成員的轉(zhuǎn)錄水平, 探究β-淀粉酶對油菜高收獲指數(shù)的貢獻, 挖掘與高收獲指數(shù)相關(guān)的BAM基因, 為進一步通過分子育種提高油菜收獲指數(shù)提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

從前期鑒定的收獲指數(shù)極端差異材料中選擇生育期和營養(yǎng)體相似、收獲指數(shù)高和低差異明顯的純合自交系3份, 分別為高產(chǎn)高收獲指數(shù)型(HH)、高產(chǎn)低收獲指數(shù)型(HL)、低產(chǎn)低收獲指數(shù)型(LL)[8]。材料由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 實驗設(shè)計與取樣

于2015年9月至2016年5月在重慶北碚, 采用育苗移栽方式, 按隨機區(qū)組3次重復(fù)試驗種植3種不同收獲指數(shù)型材料, 每個材料40株(10株×4行), 行距40 cm, 株距25 cm。按當(dāng)?shù)赜筒烁弋a(chǎn)栽培方式施肥及管理。終花期開始至青角中期, 每隔5 d從每小區(qū)選擇生長正常、長勢一致的3個植株混合取樣, 分別取其莖、葉片、角果皮、種子凍于液氮中, 取樣5次, 存儲于-80℃, 用于基因表達分析與酶活性測定。

1.3 甘藍型油菜收獲指數(shù)的確定

油菜成熟后從每小區(qū)選擇生長正常、長勢一致的10個植株, 將每株子葉節(jié)以上全部曬干后稱重, 作為單株生物產(chǎn)量; 將每株所有角果脫粒, 種子曬干后獲得單株經(jīng)濟產(chǎn)量; 收獲指數(shù)(HI)為經(jīng)濟產(chǎn)量占生物產(chǎn)量的百分?jǐn)?shù)。

1.4 基因表達分析

采用TransZol RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取總RNA。用DNase I (TaKaRa)消化去除基因組DNA。按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行樣品cDNA的合成。

根據(jù)擬南芥、甘藍型油菜β-淀粉酶基因家族成員保守序列設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)。按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)說明, 反應(yīng)體系含2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol L–1上下游引物各0.4 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。在qTOWER2.2熒光定量PCR儀(德國耶拿)上進行PCR擴增, 擴增程序為95℃ 30 s; 95℃5 s, 56℃ 30 s, 40個循環(huán)。為內(nèi)參基因。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù), 2個技術(shù)重復(fù)。

1.5 β-淀粉酶活性測定

從每小區(qū)選擇長勢一致的3個植株混合取樣, 分別稱取其莖、葉片、角果皮、種子各0.1 g, 液氮下研磨成粉末, 加入9 mL pH 7.2的磷酸緩沖液混勻, 全部轉(zhuǎn)移至離心管中, 于4℃、3000 ×離心15 min, 取上清液為待測樣品酶液。采用酶聯(lián)免疫分析測定β-淀粉酶活性。用純化的植物β-淀粉酶抗體包被微孔板, 制成固相抗體, 往包被單抗的微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品酶液, 再與HRP標(biāo)記的β-淀粉酶抗體結(jié)合, 形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物, 經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。按植物β-淀粉酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒(酶聯(lián)生物)說明書, 用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度, 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中β-淀粉酶活性濃度(U mL-1)。以每克植物組織中所具有的酶活力單位作為酶活性單位。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析比較不同油菜品種的產(chǎn)量與收獲指數(shù)差異(SPSS 15.0), 顯著水平為<0.05; 利用SigmaPlot 10.0繪制相關(guān)圖表。

表1 qPCR相關(guān)引物

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甘藍型油菜品種的收獲指數(shù)

由圖1可知, 3個油菜品種(HH、HL、LL)的生物產(chǎn)量和收獲指數(shù)存在顯著差異。HH型的單株生物產(chǎn)量與收獲指數(shù)都是最高的, HL型次之, LL型最低。

2.2 不同收獲指數(shù)甘藍型油菜β-淀粉酶活性的動態(tài)變化

采用酶聯(lián)免疫法分析了3種不同收獲指數(shù)型甘藍型油菜終花期后莖、葉、角果皮以及種子中β-淀粉酶活性的動態(tài)變化。由圖2可知, β-淀粉酶活性在所檢測“源”器官中隨發(fā)育時期呈上升趨勢。HH型油菜葉片、角果皮中的β-淀粉酶活性顯著高于其他2個品種。莖中的β-淀粉酶活性在品種間的差異與葉片、角果皮不同, LL型油菜莖中的β-淀粉酶活性顯著高于其他2個品種。種子中, 3個材料均表現(xiàn)出下降–升高–下降的趨勢, 其中HL型油菜在花后20 d、25 d時酶活性顯著減少。

2.3 β-淀粉酶基因家族成員在不同收獲指數(shù)甘藍型油菜莖、葉、角果皮及種子中的表達分析

2.3.1 在莖中的表達分析 油菜終花期后5、10、15、20、25 d分別取HH、HL與LL型油菜的莖提取RNA, 對BAM基因家族成員的表達水平進行分析。由圖3可知,與在3種不同類型油菜莖中的表達量總體隨發(fā)育時期呈上升趨勢,在品種間無顯著差異,在LL型油菜花后20 d時的表達量顯著高于其他2個品種。在HL與LL莖中表達量總體隨發(fā)育時期也呈現(xiàn)上升的趨勢, 但在LL油菜中的表達量顯著高于HL?；蛟贖L和LL油菜中的表達量在花后10 d達到最高, 之后恢復(fù)至初始水平。與HL和LL相比,與在HH型油菜花后不同發(fā)育時期莖中低水平表達, 隨發(fā)育時期無明顯變化。

圖1 不同油菜品種的產(chǎn)量與收獲指數(shù)

HH: 高產(chǎn)高收獲指數(shù)型油菜; HL: 高產(chǎn)低收獲指數(shù)型油菜; LL: 低產(chǎn)低收獲指數(shù)型油菜; HI: 收獲指數(shù)。圖中柱形圖上方不同小寫字母表示品種間差異顯著(< 0.05)。

HH: high-yield and high-harvest index rapeseed; HL: high-yield and low-harvest index rapeseed; LL: low-yield and low-harvest index rapeseed; HI: harvest index. Different letters above the column indicate significant difference at< 0.05 among varieties.

圖2 甘藍型油菜不同發(fā)育時期不同組織器官β-淀粉酶活性的動態(tài)變化

縮寫同圖1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

2.3.2 在葉片中的表達分析 油菜終花期后不同時期分別取HH、HL與LL型油菜的葉片提取RNA, 對BAM基因家族成員的表達水平進行分析。由圖4可知,、和在3種不同類型油菜葉片中的表達量隨發(fā)育時期總體呈上升趨勢, 其中在HH型油菜花后25 d的表達量顯著高于HL與LL。在HH、HL油菜花后20 d葉片中的表達量大幅增加, 25 d時顯著高于其他基因在各組織器官、各個時期的表達量。

圖3 甘藍型油菜不同發(fā)育時期莖內(nèi)β-淀粉酶基因家族成員的表達

縮寫同圖1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

圖4 甘藍型油菜不同發(fā)育時期葉片β-淀粉酶基因家族成員的表達

縮寫同圖1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

2.3.3 在角果皮中的表達分析 由圖5可知,、和在3種不同類型油菜角果皮中的表達量總體隨發(fā)育時期呈上升趨勢; 花后20 d、25 d時,、、和基因在HH型油菜中的表達量均顯著高于HL與LL型油菜。

2.3.4 在種子中的表達分析 利用qPCR對β-淀粉酶基因家族成員在不同收獲指數(shù)型甘藍型油菜種子中的表達情況進行分析。由圖6可知,和在3種不同類型油菜種子中總體低水平表達。HL型油菜中與在花后15 d時表達量顯著高于其他2個品種, 之后表達量下降。

圖5 甘藍型油菜不同發(fā)育時期角果皮β-淀粉酶基因家族成員的表達

縮寫同圖1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

圖6 甘藍型油菜不同發(fā)育時期種子β-淀粉酶基因家族成員的表達

縮寫同圖1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

3 討論

“源”充足、“流”暢通、“庫”容大是作物高收獲指數(shù)形成的三大要素。油菜具有充足的“源”和“庫”, 但收獲指數(shù)與其他作物相比卻偏低, 其主要受限因子在“流”[9]。如何有效促進光合產(chǎn)物向籽粒運輸與分配是提高油菜收獲指數(shù)、實現(xiàn)油菜高產(chǎn)的有效途徑。袁婺洲等[2-3]研究報道油菜角果皮內(nèi)的淀粉酶活性調(diào)控淀粉向可溶性糖的轉(zhuǎn)變, 并進而影響光合產(chǎn)物向籽粒的運輸強度, 其酶活性與收獲指數(shù)呈顯著正相關(guān)。李加納等[8]報道收獲指數(shù)高的油菜角果皮的蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶以及淀粉酶活性較高, 有利于淀粉降解為蔗糖, 為籽粒提供營養(yǎng)物質(zhì)。植物體內(nèi)的a-淀粉酶和β-淀粉酶都通過催化支鏈淀粉和直鏈淀粉水解產(chǎn)生麥芽糖。有實驗證據(jù)表明, β-淀粉酶及其基因家族成員在植物淀粉降解和基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5-6]。油菜β-淀粉酶途徑與高收獲指數(shù)的關(guān)系還不清楚。莖、葉片以及角果是油菜在不同發(fā)育時期光合產(chǎn)物的主要來源[10-11]。在生殖生長早期, 葉片中產(chǎn)生的光合產(chǎn)物被運輸?shù)交ê徒枪衃12]。在籽粒灌漿過程中, 葉片的貢獻隨著衰老而逐漸減小, 轉(zhuǎn)而由角果提供的光合產(chǎn)物來充實種子[10,13]。本研究表明, β-淀粉酶活性在所檢測“源”器官中隨發(fā)育時期總體呈增加趨勢, 高收獲指數(shù)油菜葉片與角果皮中的β-淀粉酶活性從花后15 d開始顯著高于低收獲指數(shù)油菜。葉片與角果皮中較高的β-淀粉酶活性, 有利于淀粉降解并向籽粒運輸營養(yǎng)物質(zhì), 從而貢獻了高收獲指數(shù)。

β-淀粉酶是多基因家族, 擬南芥β-淀粉酶基因家族(β-amylase, BAM)成員有9個[14-15], 根據(jù)氨基酸序列同源性分為亞家族I (和)、亞家族II (和)、亞家族III (和)和亞家族IV (、和)[16]。根據(jù)這些基因在淀粉分解中的作用, 本研究選擇、、、, 分析了它們在不同收獲指數(shù)油菜中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,在油菜莖、葉及角果皮中的表達量總體隨發(fā)育時期增加, 花后25 d時,在高收獲指數(shù)油菜各“源”器官中的表達量均顯著高于低收獲指數(shù)油菜。在高收獲指數(shù)油菜葉片、角果皮中的表達量在花后25 d時顯著高于低收獲指數(shù)油菜, 且在高收獲指數(shù)油菜花后25 d葉片中的表達量顯著高于其他基因在各組織器官、各個時期的表達量。已有證據(jù)表明,和在擬南芥質(zhì)體淀粉降解中起重要作用[16-17]。其中在保衛(wèi)細胞中起主要作用, 在白天通過降解淀粉促進氣孔開放[18-19], 而在葉肉細胞淀粉降解中起主導(dǎo)作用[17,20-21]。本研究中,和基因在高收獲指數(shù)油菜籽實充實期葉片與角果中高表達, 暗示和基因可能通過促進葉片與角果皮淀粉分解而加強光合產(chǎn)物向籽粒的運輸強度, 從而提高油菜的收獲指數(shù)。β-淀粉酶活性測定結(jié)果也支持這一觀點。

可能以獨立于和途徑的方式調(diào)控擬南芥淀粉降解[16]。定位于細胞質(zhì)的BAM5蛋白對淀粉的親和力遠高于其他定位于質(zhì)體的BAMs[22], 擬南芥葉片中90%的β-淀粉酶活性是由基因座編碼的[23]。本研究中,與在油菜莖、葉及角果皮中的表達量總體隨發(fā)育時期增加, 在高收獲指數(shù)油菜角果皮中的表達量分別于花后15 d與20 d開始顯著高于低收獲指數(shù)油菜。這表明, 油菜中與基因可能主要通過上調(diào)角果皮表達量而調(diào)控淀粉分解與光合產(chǎn)物向籽粒的運輸。

不同收獲指數(shù)油菜莖中的β-淀粉酶活性及其基因表達與葉片、角果表現(xiàn)不同, 低產(chǎn)低收獲指數(shù)型油菜莖中表現(xiàn)出較高的β-淀粉酶活性及其基因表達水平(、)。這種β-淀粉酶與收獲指數(shù)的不一致可能與低生物產(chǎn)量背景有關(guān)。前人研究認(rèn)為, 油菜的經(jīng)濟產(chǎn)量首先受生物產(chǎn)量的影響, 其次才受收獲指數(shù)的影響, 只有在高生物產(chǎn)量背景下提高收獲指數(shù)才有意義[24]。β-淀粉酶活性在3個不同收獲指數(shù)油菜種子中均表現(xiàn)出下降-升高-再下降的趨勢。高收獲指數(shù)油菜β-淀粉酶活性在后期高于低收獲指數(shù), 其中顯著高于低產(chǎn)低收獲指數(shù)油菜。和在種子中總體低水平表達,與可能主要參與油菜種子中淀粉的調(diào)控。

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Activity and gene family expression of β-amylase indiffering in harvest index

JIN Shu-Rong1,2,**, WANG Yan-Mei1,2,**, CHANG Yue1,2, WANG Yue-Hua1,2, LI Jia-Na1,2, and NI Yu1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

The transferring efficiency of photosynthate from source organs to grains is the key process to increase the harvest index inandamylase activity in source organs affects the transport intensity of assimilates to grains. The relationship between β-amylase (BAM) and the formation of high harvest index in rapeseed had not been clear. In this study, three different inbred lines, high-yield and high-harvest index rapeseed, high-yield and low-harvest index rapeseed, and low-yield and low-harvest index rapeseed were selected, and stem, leaf, silique pericarp and seed were sampled at 5, 10, 15, 20, and 25 d after the final flowering to analyze the activity of β-amylase and the expression level of its gene family members. The activity of β-amylase increased with the development of source organs. The activity of β-amylase in leaves and silique pericarps of high-harvest index rapeseed was significantly higher than that of low-harvest index rapeseed. In the β-amylase gene family, the expression of,, andin the stem, leaf and silique pericarp of rapeseed increased with the development of organs. At 25 d after the final flowering, the expression ofandin leaves and silique pericarps of high-harvest index rapeseed was significantly higher than that of low harvest index rapeseed. The expression ofandin the silique pericarps of rapeseed with high harvest index was significantly higher than that of rapeseed with low harvest index at 15 d and 20 d after the final flowering. Taken together,andmay enhance the transport intensity of photosynthate to grains by promoting starch degradation in leaves and silique pericarps in rapeseed with high harvest index, andandmay regulate the transport of photosynthate to grains mainly by acting on starch degradation in silique pericarps.andmay also be involved in the regulation of starch in rapeseed seeds.

; harvest index; β-amylase; gene expression

2019-01-01;

2019-04-15;

2019-05-08.

10.3724/SP.J.1006.2019.94001

倪郁, E-mail: nmniyu@126.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

靳舒榮, E-mail: 1509512475@ qq.com; 王艷玫, E-mail:18113560032 @163.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31771694), 重慶市基礎(chǔ)研究與前沿探索項目(cstc2018jcyjAX0263, cstc2016jcyjA0170), 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(XDJK2017B028)和國家現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-12)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31771694), the Chongqing Basic and Advanced Research Project (cstc2018jcyjAX0263, cstc2016jcyjA0170), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2017B028), and the China Agriculture Research System (CARS-12).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190505.1413.006.html