GA結(jié)合蛋白亞單位a在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

姜洪勝，孫建華，吳泉峰，黃國全

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全球癌癥發(fā)病率的近10%，且病死率高[1-2]。雖然結(jié)腸癌的治療手段取得一定的進(jìn)展，但是由于難以早期診斷而錯(cuò)過最佳治療時(shí)間，結(jié)腸癌患者生存率仍然很低。因此，迫切需要尋求新的可靠的生物標(biāo)志物用于評估結(jié)腸癌的預(yù)后。GA結(jié)合蛋白亞單位a(GA binding protein transcription factor alpha subunit，GABPA)是GA結(jié)合蛋白a鏈，是由GABPA基因編碼的三個(gè)亞單位之一，其作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，發(fā)揮著DNA結(jié)合的功能，并且它還參與了細(xì)胞色素氧化酶的活化和線粒體功能的細(xì)胞核調(diào)控機(jī)制[3-4]。本研究通過檢測結(jié)腸癌患者與相應(yīng)的癌旁組織的GABPA表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討GABPA在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2007年1月—2011年12月湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者174例癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，每例均有完整的臨床背景資料和病理組織學(xué)切片診斷支持，所有病例均經(jīng)至少2位病理學(xué)專家確診為結(jié)腸癌。所有標(biāo)本均為手術(shù)切除后獲取的石蠟標(biāo)本，所有病例在術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫治療和分子靶向治療。

1.2 GABPA檢測方法 按照北京中杉金橋公司試劑盒的說明書進(jìn)行SP二步法免疫組化染色，具體步驟如下: 石蠟切片放入60℃ 烤箱內(nèi)烘烤1 h;切片常規(guī)二甲苯溶液脫蠟、酒精梯度脫水; 95℃以上用EDTA抗原修復(fù)25 min，自然冷卻至室溫; 3% H2O2室溫靜置10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，每次5 min;甩干PBS，滴加GABPA兔抗人單克隆抗體(購自Abcam公司)，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜; PBS 清洗3次，每次3 min;滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次2 min;滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次2 min;滴加DAB顯色液(購自武漢博士德生物工程有限公司)，鏡下掌握顯色程度;自來水充分沖洗;蘇木素復(fù)染1 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判定 每張石蠟切片在10×40倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，GABPA蛋白陽性表達(dá)為棕黃或棕褐色染色，定位于胞漿。按以下標(biāo)準(zhǔn)評分: 0分，不著色或僅有弱著色；1分，淺棕色；2分，深棕色。計(jì)算每個(gè)視野下的陽性細(xì)胞數(shù)，著色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。應(yīng)用染色強(qiáng)度評分值與陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分值相加，對GABPA蛋白的表達(dá)分為：低表達(dá)0～4分，高表達(dá)5～6分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或率(%)表示，采用卡方檢驗(yàn)分析GABPA表達(dá)水平高低與臨床病理特征的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier分析評估GABPA蛋白表達(dá)對結(jié)腸癌患者生存率的影響；采用Cox回歸(比例風(fēng)險(xiǎn)模型)對預(yù)后因素進(jìn)行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GABPA蛋白在結(jié)腸癌組織及癌旁組織的表達(dá) 運(yùn)用免疫組化檢測174例結(jié)腸癌組織和對應(yīng)的癌旁正常組織中GABPA蛋白的表達(dá)情況。GABPA陽性染色為棕黃色或深褐色，其主要表達(dá)定位于細(xì)胞漿中(圖1見封3)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，癌組織GABPA的陽性表達(dá)為20.11%(35/174)，顯著低于癌旁組織55.17%(96/174)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.23,P<0.05)。

2.2 GABPA蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 為研究GABPA的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間是否相關(guān)，將結(jié)腸癌組織中GABPA表達(dá)量取平均值分為低表達(dá)組84例和高表達(dá)組90例。GABPA蛋白在結(jié)腸癌中的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05),而GABPA蛋白高表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、血管侵潤和分化程度無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.3 GABPA表達(dá)水平與臨床預(yù)后之間的關(guān)系 隨訪8年，分析了結(jié)腸癌患者的臨床信息。174例結(jié)腸癌患者中死亡92例(GABPA低表達(dá)組56例，GABPA高表達(dá)組36例)。利用Kaplan-Meier分析結(jié)腸癌患者中GABPA表達(dá)水平與臨床預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GABPA高表達(dá)的患者相比，GABPA低表達(dá)的患者總生存的平均天數(shù)更短(χ2=7.15,P= 0.006)，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier分析結(jié)腸癌患者GABPA表達(dá)水平與臨床預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)

2.4 采用Cox回歸(比例風(fēng)險(xiǎn)模型)對預(yù)后因素進(jìn)行分析 單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、血清GABPA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者總生存率相關(guān)(P<0.05)。多變量Cox回歸分析顯示，GABPA低表達(dá)是結(jié)直腸癌患者的預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.813，95%CI1.035～4.911，P=0.013)，見表2。

3 討 論

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。每年全世界有超過60萬人因結(jié)腸癌死亡[5-7]。盡管結(jié)腸癌在治療方面取得了巨大進(jìn)展，但由于其易轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌的預(yù)后仍然很差[2]。因此，尋找有效可行的評估結(jié)腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物極其重要。

GABPA在胚胎發(fā)育、先天性免疫、獲得性免疫、骨髓和造血干細(xì)胞分化中發(fā)揮作用[8-12]。研究表明,GABPA在膀胱癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可以選擇性結(jié)合于突變的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動(dòng)子產(chǎn)生的ETS轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，從而激活TERT表達(dá)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，GABPA可通過調(diào)控激酶互作的序列域(KIS)的表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移[15]。因此，GABPA對癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用可能具有組織特異性，并且可能涉及不同細(xì)胞中的不同信號傳導(dǎo)途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，GABPA蛋白在結(jié)腸癌組織中顯著低表達(dá)，而在癌旁組織中高表達(dá)，提示GABPA在結(jié)直腸中可能作為抑癌基因參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，這與GABPA在其他多種類型腫瘤中低表達(dá)結(jié)果相一致。GABPA蛋白的低表達(dá)與結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示GABPA在結(jié)腸癌的發(fā)展中起到抑制作用。TNM分期越高，GABPA陽性表達(dá)率越低，提示GABPA在結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中有重要作用。

表1 結(jié)腸癌組織GABPA表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

表2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對預(yù)后因素進(jìn)行單變量和多變量回歸分析

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GABPA在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，且GABPA與結(jié)腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，可能是結(jié)腸癌的一項(xiàng)新的獨(dú)立預(yù)后因子。因此，深入研究GABPA在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，可為結(jié)腸癌治療提供新的治療靶點(diǎn)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

姜洪勝：查找文獻(xiàn)，完成實(shí)驗(yàn)所有部分，論文撰寫；孫建華：完成部分實(shí)驗(yàn)，論文指導(dǎo)，吳泉峰：統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；黃國全：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，論文審核