穿破石總黃酮抗氧化性的研究

許丹妮　梁云貞　韋方立

摘要：為了探討穿破石（Radix Cudramiae）總黃酮抗氧化活性，采用不同方法（Fenton法、鄰苯三酚自氧化法和DPPH法）測定了穿破石總黃酮的抗氧化活性，以維生素C為陽性對照。結(jié)果表明，穿破石總黃酮清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力比維生素C強(qiáng)，其EC50分別為2.33、2.15、0.27 μg/mL，維生素C清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的EC50分別為12.88、7.76、11.23 μg/mL。

關(guān)鍵詞：穿破石（Radix Cudramiae）;總黃酮;抗氧化性

中圖分類號：Q949.737.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）11-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.11.022? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Antioxidant activity of total flavonoids from Radix Cudraniae

XU Dan-ni，LIANG Yun-zhen，WEI Fang-li

（Guangxi Normal University of Nationalities，Chongzuo 532200，Guangxi，China）

Abstract： In order to study the antioxidant activity of total flavonoids from Radix Cudraniae， taking vitamin C as positive control， the antioxidant activity of total flavones from Radix Cudraniae was determined by different methods， including Fenton reaction， self-oxidation of 1， 2， 3-phentriolassay method and DPPH radical-scavengings. The results show that the flavonoids from Radix Cudraniae have very strong scavenging capabilities for hydroxyl radical， superoxide anion and DPPH free radical， their EC50 values are 2.33， 2.15 and 0.27 μg/mL， respectively， and the EC50 of vitamin C scavenging capabilities for hydroxyl radical， superoxide anion and DPPH free radical are 12.88， 7.76 and 11.23 μg/mL， respectively.

Key words： Radix Cudramiae; total flavonoids; antioxidation

黃酮類化合物是一類廣泛分布在植物界中、具有多種生物活性的多酚類化合物。大量研究表明，植物中提取的黃酮類化合物具有抗心腦血管疾病、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種功效，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1，2]。近年來，對黃酮的抗氧化性研究備受關(guān)注，從自然界開發(fā)更多的天然黃酮類化合物已成為研究熱點(diǎn)。

穿破石（Radix Cudramiae）為?？浦参镨蠘鋄Cudrania tricuspidata （Carr.） Bur. ex Lavallee]的根，全年可采，洗凈切片曬干，以根（黃色）入藥。生于山坡，溪邊、灌叢中，分布于湖南、浙江、安徽、福建、廣東、廣西等地。相關(guān)醫(yī)藥書籍的記載：《嶺南采藥錄》：“祛風(fēng)濕，十蒸九曬; 治跌打，酒煎服; 肩瘡和蜜搗敷。”《南寧市藥物志》：“血通經(jīng)，治淋濁，去遠(yuǎn)年瘀積、結(jié)石?！薄稄V西實(shí)用中草藥新選》：“清熱活血，止咳祛痰，治勞傷咳血?！爆F(xiàn)代研究文獻(xiàn)報道，穿破石具有祛風(fēng)利濕、活血通經(jīng)等功效，能治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、黃疸、淋濁、蠱脹、閉經(jīng)、勞傷咳血、跌打損傷及疔瘡癰腫等病癥，是目前民間常用本草中藥，極具開發(fā)利用價值[3-5]。目前鮮見有關(guān)穿破石根總黃酮的抗氧化活性的研究報道，為此，本研究對穿破石根總黃酮進(jìn)行提取，采用3種目前較為成熟的檢測方法對其體外抗自由基活性進(jìn)行檢測，確定其抗氧化功能，以期為更好地開發(fā)和利用穿破石資源，開發(fā)新的安全的天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 穿破石原材料? 穿破石采自廣西龍州縣彬橋鄉(xiāng)小青山，經(jīng)廣西民族師范學(xué)院食品與生物工程學(xué)院植物學(xué)科黃秋蟬教授和梁云貞副教授鑒定為?？浦参镨蠘涞母?/p>

1.1.2? 試劑? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（購自Bioszune.Inc.，純度≥98%）、鄰二氮菲、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）（CAS：1898-66-4，上海晶品純試劑有限公司）、鄰苯三酚、無水乙醇、雙氧水、抗壞血酸（維生素C）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸95%、乙醇。

1.1.3? 主要儀器、設(shè)備? UV-1601型紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利儀器有限公司）、KJ23B-AN型美的微波爐（廣東美的微波爐制造有限公司）、FW800型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、AR124CN型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]、PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海今邁儀器儀表有限公司）、DKS-12型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠）、SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 穿破石總黃酮的提取? 穿破石→清洗→烘干（60 ℃）→粉碎、過60目篩（貯藏于干燥箱中備用）→稱重→熱乙醇浸提→微波處理→抽濾→收集濾液→4 ℃冷藏備用。

1.2.2? 穿破石總黃酮含量的測定

1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。稱取蘆丁對照品25.0 mg，置于100 mL容量瓶中加80%乙醇溶解，定容。吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL蘆丁溶液分別置于50 mL容量瓶中加5%亞硝酸鈉1.5 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁1.5 mL混勻，放置6 min，加4% NaOH 20 mL，再加80%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以80%乙醇為空白對照，在510 nm下測定吸光度，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）穿破石總黃酮含量的測定。取“1.2.1”所得穿破石黃酮提取液1 mL于50 mL容量瓶中，按“1.2.2”中的NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法進(jìn)行操作，于510 nm處測定吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品總黃酮的含量。

1.2.3? 穿破石總黃酮抗氧化活性的測定

1）對·OH清除活性的測定。采用Fenton反應(yīng)進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)[6]和[7]的方法并做適當(dāng)修改。每管以0.5 mL鄰二氮菲（7.5 mmol/L）與0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.75 mmol/L，pH 7.4）和0.5 mL NH4Fe（SO4）2（7.5 mmol/L）溶液混勻，再加入0.5 mL 0.1%的H2O2溶液，以H2O代替H2O2為未損傷管，樣品管加入1.0 mL不同濃度穿破石總黃酮提取液，未損傷管與損傷管以H2O代替，混勻后置于37 ℃水浴60 min，536 nm處測定吸光度。用一定濃度梯度的維生素C溶液作為陽性對照，根據(jù)以下公式計(jì)算·OH清除率。

清除率=[（A 樣品-A 損傷）/（A 未損傷-A 損傷）]×100%

式中，A 樣品為樣品管吸光度，A 未損傷為未損傷管吸光度，A 損傷為損傷管吸光度。

2）對超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用的測定。采用鄰體三酚自氧化方法進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)[8]的方法并做適當(dāng)修改。取3.5 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）加入1.0 mL不同濃度的樣品溶液混勻，于25 ℃水浴20 min后加入0.5 mL鄰苯三酚溶液（50 mmol/L，用10 mmol/L HCl配制，25 ℃水浴20 min預(yù)熱），混勻于25 ℃水浴反應(yīng)4 min（自加入鄰苯三酚開始計(jì)算時間）即加入3滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)。于325 nm處測吸光度（A 樣品）。用超純水代替樣品測空白管吸光度（A），對照管用10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚溶液，測吸光度（A 對照）。用一定濃度梯度的維生素C溶液作為陽性對照，以下列公式計(jì)算O2-·清除率。

清除率=[1-（A 樣品-A 對照）/（A-A 對照）]×100%

式中，A 樣品為樣品管吸光度，A 為空白管吸光度，A 對照為對照管吸光度。

3）對DPPH清除活性的測定。參照文獻(xiàn)[9]和[10]的方法并做改進(jìn)。精確稱取39.4 mg DPPH，加入95%的乙醇溶解并定容至500 mL，配制成0.2 mmol/L DPPH溶液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。使用前將其稀釋成0.1 mmol/L。樣品管中加入1.0 mL不同濃度的樣品溶液和4.0 mL DPPH溶液，以95%乙醇代替DPPH溶液作為對照，以超純水代替樣品作空白對照，以上3組置于30 ℃水?。ū芄猓?0 min后，用超純水調(diào)零于517 nm處測吸光度。用一定濃度梯度的維生素C作為陽性對照，用以下公式計(jì)算對樣品溶液DPPH的清除率。

清除率=[1-（A 樣品-A 對照）/（A-A 對照）]×100%

式中，A 樣品為樣品管吸光度，A 為空白管吸光度，A 對照為對照管吸光度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 穿破石總黃酮含量的測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回歸方程建立按“1.2.2”所示方法進(jìn)行，可得回歸方程：A=11.533C+0.008， 相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8，其線性關(guān)系很好。取“1.2.1”所得穿破石根總黃酮提取液1 mL于50 mL容量瓶中， 按“1.2.2”項(xiàng)下NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法進(jìn)行操作，于510 nm處測定吸光度，根據(jù)蘆丁的回歸方程計(jì)算樣品總黃酮的含量。

2.2? 穿破石總黃酮抗氧化活性

2.2.1? 對·OH的清除活性? 穿破石總黃酮和維生素C對·OH自由基的清除效果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著總黃酮濃度的增加，其清除·OH的能力逐步增強(qiáng)。在1.54～7.70 μg/mL范圍內(nèi)，穿破石總黃酮對·OH自由基有明顯的清除作用，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。根據(jù)回歸方程計(jì)算，其清除率為50%的有效濃度EC50為2.33 μg/mL，而維生素C對·OH清除作用的EC50為12.88 μg/mL，說明穿破石總黃酮對·OH的清除作用強(qiáng)于維生素C。

2.2.2? 對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除活性? 穿破石總黃酮和維生素C對O2-·的清除效果如圖2所示。由圖2可以看出，隨著總黃酮濃度的增加，其清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力逐步增強(qiáng)。在0.99～3.96 μg/mL范圍內(nèi)，穿破石總黃酮對超氧陰離子自由基（O2-·）有明顯的清除作用，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。根據(jù)回歸方程計(jì)算，其清除率為50%的有效濃度EC50為2.15 μg/mL，而維生素C對超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用的EC50為7.76 μg/mL，說明穿破石總黃酮對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用強(qiáng)于維生素C。

2.2.3? 對DPPH的清除活性? 穿破石總黃酮和維生素C對DPPH的清除效果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著總黃酮濃度的增加，其清除DPPH的能力逐步增強(qiáng)。在0.11～0.56 μg/mL范圍內(nèi)，穿破石總黃酮對DPPH自由基有明顯的清除作用，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。根據(jù)回歸方程計(jì)算，其清除率為50%的有效濃度EC50為0.27 μg/mL，而維生素C對DPPH自由基清除作用的EC50為11.23 μg/mL，說明穿破石總黃酮對DPPH自由基的清除作用強(qiáng)于維生素C。

3? 小結(jié)與討論

穿破石是壯族人民常用的中草藥，其中含有的黃酮類物質(zhì)具有多種生物活性，梁云貞等[11]、許元明等[12]已經(jīng)優(yōu)化穿破石中黃酮的提取工藝，用紫外分光光度法測量穿破石提取液中黃酮的含量。另有黃秀香等[13]采用復(fù)合酶輔助超聲提取穿破石中黃酮苷進(jìn)行工藝優(yōu)化。在藥理方面，金俊杰等[14-16]研究表明，穿破石水提取物和醇提取物對急性肝損傷、肝纖維化有一定的保護(hù)和治療作用，在急性毒性實(shí)驗(yàn)研究方面也表明穿破石水提取物和醇提取物無急性毒性。以上的研究說明穿破石具有較高的藥用價值，為了進(jìn)一步開發(fā)利用穿破石資源，探討其抗氧化活性，該研究從穿破石中提取總黃酮，并對其抗氧化性進(jìn)行研究。

自由基可以與細(xì)胞內(nèi) DNA、蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸（PUFA）發(fā)生作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白—蛋白交聯(lián)、蛋白—DNA交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化，引起機(jī)體的細(xì)胞和組織損害，影響功能，引發(fā)各種病變，因此清除自由基對抗氧化具有重要的意義。試驗(yàn)結(jié)果表明，穿破石總黃酮清除羥自由基、超氧負(fù)離子自由基和DPPH自由基的能力比維生素C強(qiáng)，穿破石總黃酮除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的EC50分別為2.33、2.15、0.27 μg/mL，維生素C清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的EC50分別為12.88、7.76、11.23 μg/mL。因此穿破石總黃酮具有良好的抗氧化能力，是一種天然有效的自由基清除劑，本研究結(jié)果可為穿破石作為植物資源藥物的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

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