白藜蘆醇對肺腺癌95D裸鼠移植瘤增殖及轉(zhuǎn)移的影響

陳海霞

【摘 要】本文通過皮下接種和尾靜脈注射建立裸鼠皮下移植瘤及靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型，采用完全隨機(jī)分組方法分為生理鹽水對照組和白藜蘆醇組（100mg/kg），腹腔注射白藜蘆醇進(jìn)行治療，NightOWLⅡLB983動物成像儀測定皮下移植瘤生長狀況和肺轉(zhuǎn)移灶改變，移植瘤標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)觀察，免疫組化檢測MMP2、TIMP2表達(dá)變化。得出白藜蘆醇有抑制肺腺癌細(xì)胞增殖效應(yīng)，并具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移作用，其機(jī)制可能涉及對MMP2、TIMP2表達(dá)的調(diào)控。

【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇;肺腫瘤;裸鼠

【中圖分類號】R539【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1005-0019（2019）13-0-02

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率占第一位的惡性腫瘤，臨床上預(yù)后較差，也是近年來重要的抗腫瘤研究對象，1940年首次從毛葉葉黎蘆的根部分離得到白藜蘆醇（resveratrol， Res），其是一種活性非黃酮多酚物質(zhì)，在植物受到病原性進(jìn)攻或環(huán)境惡化時產(chǎn)生。近年來又發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗腫瘤作用，對肺癌細(xì)胞有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，本實(shí)驗(yàn)主要研究白藜蘆醇對肺癌移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與細(xì)胞株

Luciferase-95D細(xì)胞珠購自賽業(yè)生物公司;基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase， MMP2）、金屬蛋白酶組織抑制劑2（tissue inhibitors of metalloproteinase， TIMP2）購自Sant Cruz公司，Matrigel購自美國BD公司;BALB/C裸鼠，6-8周齡，體重20-25g，由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供等。

1.2 裸鼠飼養(yǎng) 裸鼠飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，相對濕度40%-60%，溫度25℃，實(shí)驗(yàn)裸鼠所用鼠籠、墊料、食物、水等均經(jīng)過消毒處理。

1.3 肺癌細(xì)胞移植瘤模型的建立 取對數(shù)生長期Luciferase-95D細(xì)胞，經(jīng)消化、離心，制備5×106個/ml細(xì)胞懸液，每只裸鼠背部皮下種植0.2 ml細(xì)胞懸液形成皮下移植瘤，尾靜脈種植0.2ml細(xì)胞懸液形成肺轉(zhuǎn)移瘤，待瘤增長至100mm3，按完全隨機(jī)分組方法將裸鼠分成對照組和白藜蘆醇組，分組5只，進(jìn)行給藥，白藜蘆醇組給于100mg/kg/d，對照組給于等體積的生理鹽水對照，給藥途徑均為腹腔注射，每天1次，每5天活體熒光成像儀測量一次腫瘤結(jié)節(jié)的光量子強(qiáng)度，繪制各組腫瘤的生長曲線。

1.4 移植瘤組織病理學(xué)觀察 末次給藥6 h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束將裸鼠拉頸處死，取皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤，10%的福爾馬林固定過夜，標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟常規(guī)制備出瘤組織石蠟切片，經(jīng)過蘇木精-伊紅染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察各組移植瘤組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測移植瘤MMP-2、TIMP-2的表達(dá) 制備好的石蠟切片脫蠟，按免疫組織化學(xué)反應(yīng)步驟操作：第一抗體基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2均為1∶200稀釋;山羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）稀釋度1∶300，各步驟間用PBS充分浸洗，30%甘油封片，顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，計量資料符合正態(tài)分布，使用表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 裸鼠治療前后一般情況變化 應(yīng)用白藜蘆醇治療期間裸鼠進(jìn)食、飲水等均未發(fā)生明顯變化，但是隨治療時間的延長，白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組個別裸鼠體重減輕明顯，有的裸鼠出現(xiàn)短暫的腹瀉、便血，無需治療，停藥后既可自行緩解，考慮胃腸道受藥物刺激所致，實(shí)驗(yàn)期間裸鼠均未出現(xiàn)意外死亡。

2.2 白藜蘆醇對裸鼠移植瘤的抑制作用 裸鼠用藥期間每5天一次活體熒光成像儀觀察結(jié)果顯示，對照組皮下移植瘤生長較快，白藜蘆醇處理組腫瘤生長緩慢，實(shí)驗(yàn)組與對照組有顯著差異（P<0.01）;尾靜脈肺轉(zhuǎn)移瘤觀察，可見對照組肺部瘤結(jié)節(jié)較實(shí)驗(yàn)組多且大。白藜蘆醇處理組瘤結(jié)節(jié)小，多為0-2個，說明白藜蘆醇對肺癌轉(zhuǎn)移有一定抑制效應(yīng)。

2.3 裸鼠瘤組織病理學(xué)觀察白藜蘆醇誘導(dǎo)裸鼠肺癌移植瘤細(xì)胞凋亡情況

對照組皮下移植瘤切片中腫瘤細(xì)胞呈上皮樣，內(nèi)外膜完整，核漿比例高，分裂象多見，未見明顯壞死灶;白藜蘆醇治療組，瘤塊中癌細(xì)胞排列較紊亂，可見大量核固縮或碎裂的瘤細(xì)胞，瘤組織間有較多的片狀壞死灶，并可見炎癥細(xì)胞浸潤。肺組織切片顯示，肺組織內(nèi)有大量轉(zhuǎn)移瘤灶，部分相互融合，肺組織實(shí)變;并可見瘤細(xì)胞侵犯血管和氣管壁;Res組肺組織中僅見到少量小瘤結(jié)節(jié)，肺組織結(jié)構(gòu)完整，部分可見肺泡隔充血。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測白藜蘆醇對MMP2、MMP11、TIMP2表達(dá)的變化

裸鼠移植瘤石蠟切片免疫組化染色結(jié)果顯示，MMP2蛋白表達(dá)隨白藜蘆醇濃度的增加表達(dá)下降，TIMP2則升高，可能與肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3 討論

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，其化學(xué)名稱3，4，5'-三羥基苯二烯，是一種活性非黃酮類多酚化合物，已在72中植物中被發(fā)現(xiàn)，近年來備受關(guān)注，體外及動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白藜蘆醇能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，具有抗腫瘤活性，是非常有前景的天然抗腫瘤藥物，被喻為又一新的綠色抗腫瘤藥物[]。本研究結(jié)果顯示也證明白藜蘆醇可抑制裸鼠移植瘤的生長并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特征和最普遍的一種生物學(xué)行為，是一個多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程[]，涉及腫瘤細(xì)胞粘附，對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，新生血管的長入。本研究顯示，裸鼠移植瘤細(xì)胞MMP-2表達(dá)下降，而TIMP-2表達(dá)增高，由此可以抑制95D細(xì)胞對基膜降解和基膜的黏附，降低腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此，MMP2/TIMP2的表達(dá)水平有可能作為預(yù)測肺癌惡性程度的生物學(xué)指標(biāo)。

總之，本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)白藜蘆醇具有抑制肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移作用，下調(diào)移植瘤細(xì)胞MMP2的表達(dá)，同時上調(diào)TIMP2的表達(dá)可能是白藜蘆醇抑制肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，為腫瘤治療提供新的選擇，但其抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。

參考文獻(xiàn)

劉紅山， 潘承恩， 齊詠， 等. 白藜蘆醇合用5-FU對小鼠移植肝癌H22生長的影響[J]. 世界華人消化雜志， 2002， l0（1）： 32-35

Yokota J.Tumor progression and metastasis.Carcinogenesis.2000， 21（3）：497—503.