海南地區(qū)妊娠期高血壓疾病患者母嬰HLA-DRB1基因共享率研究*

韓貞艷，陳建林，關(guān)紅瓊，張程圓，韋秋圓

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，海南 海口 570311；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410011）

妊娠期高血壓疾?。╤ypertensive disorders of pregnancy,HDP）是一種臨床常見的妊娠與血壓升高并存的一組疾病，其發(fā)生率為5%～12%，是孕產(chǎn)婦和圍生兒病死率升高的主要原因，嚴(yán)重影響母嬰健康。HDP 包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)妊娠和慢性高血壓并發(fā)子癇前期。人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）是由HLA基因復(fù)合物所編碼的產(chǎn)物，是調(diào)節(jié)人體異體移植作用和免疫反應(yīng)的一組基因[1]。HLA-DR 為主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類抗原標(biāo)志物，可介導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞活化和抗原呈遞，在自我和異己的識別中扮演重要角色[2-3]。本研究通過測定50 對祖籍海南的HDP 母親及嬰兒和50 對正常妊娠母親及嬰兒的HLA-DRB1等位基因共享率，旨在初步探討HDP 的發(fā)病原因和可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2017年12月海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的50 對祖籍海南的HDP 產(chǎn)婦及其嬰兒為HDP 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：HDP 組均符合第8 版《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]HDP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：家族糖尿病、甲狀腺功能疾病、輸血史、人工助孕史、免疫治療史等。另外選取同期于本院進(jìn)行健康體檢的無HDP 的產(chǎn)婦及其嬰兒50 對為對照組。HDP 組：年齡22 ～38 歲，平均（27.7±3.2）歲；孕周30 ～38+5周，平均（34.2± 3.3）周；初產(chǎn)婦36 例，經(jīng)產(chǎn)婦14 例。對照組：年齡23 ～36 歲，平均（27.9±3.6）歲；孕周32 ～40 周，平均（35.6±3.4）周；初產(chǎn)婦38 例，經(jīng)產(chǎn)婦12 例。兩組患者年齡、孕周等基礎(chǔ)資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有產(chǎn)婦均知情同意，研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取均采集外周靜脈血4 ml，離心獲得白細(xì)胞，置入-20℃冰箱冷凍保存，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作提取DNA：Blood DNA Kit（瑞士Omega公司）。DNA 總量≥5 μg，濃度50 ～200 ng/μl，光密度（optical density,OD）為260 nm/280 nm：18.0 ～2.0。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增DRB1 位點(diǎn)擴(kuò)增2 號外顯子（目標(biāo)基因270 bp）。PCR 擴(kuò)增程序：96℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s,72℃延伸40 s,重復(fù)這 3 個(gè)步驟共35 個(gè)循環(huán),通過電泳條帶鑒定目的基因。

1.2.3 Sanger 測序?qū)CR 產(chǎn)物純化進(jìn)行Sanger 測序（SBT 法），測序反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性2 min，96℃變性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸1 min，重復(fù)這3 個(gè)步驟共25 個(gè)循環(huán)。測序反應(yīng)純化后采用3730xl基因測序儀測序。

1.2.4 分型采用HLA-3.26 版本數(shù)據(jù)庫，通過Utype分型軟件對測序峰圖進(jìn)行序列分析確定基本基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件?；蝾l率（GF）按方根法計(jì)算，按Haldane-Woof 公式計(jì)算相對危險(xiǎn)度（RR），比較采用Fisher 確切概率法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母嬰HLA-DBR1 共享（按等位基因）

HDP 組共檢出17 種等位基因，對照組共檢出16種等位基因。HDP 組未檢出DRB1*07∶01，對照組檢出4 例，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.087）。見表1。

表1 HDP 組與對照組基因共享比較 （n=50，例）

2.2 母嬰HLA-DBR1 共享按抗原情況

母嬰HLA-DBR1 共享按抗原，HDP 組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.090）。見表2。

2.3 母嬰HLA-DBR1 共享（按個(gè)數(shù)）

HDP 組分別有0、45和5例共享0、1和2個(gè)DR抗原，分別占0.00%、90.00%和10.00%；對照組分別有1、44和5例共享0、1和2個(gè)DR抗原，分別占2.00%、88.00%和10.00%。HDP 組與對照組母嬰抗原共享按個(gè)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.064）。

表2 HDP 組與對照組母嬰抗原共享情況 （n=50 對）

3 討論

研究顯示HDP 的發(fā)病呈逐年上升趨勢[5]。多數(shù)患者及家屬對HDP 的認(rèn)識程度不高，HDP 的病情輕時(shí)往往不受重視，一旦病情較重患者則擔(dān)心影響胎兒健康成長。目前，HDP 的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，多認(rèn)為其具有較高的遺傳傾向和免疫失衡性，特別是與人類基因組中具多態(tài)性的HLA 系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)[6]。

HLA 是目前發(fā)現(xiàn)與疾病關(guān)系最為緊密的基因復(fù)合體系統(tǒng)之一，根據(jù)其編碼HLA 分子的分布、多態(tài)性與功能，HLA 可分為I、Ⅱ、Ⅲ3 個(gè)基因區(qū)[7]。HLA-I類基因區(qū)位于染色體頂端，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L 10個(gè)位點(diǎn)，其中HLA-A、HLA-B、HLA-C 被稱為經(jīng)典HLA-I 類基因，是3 個(gè)最早發(fā)現(xiàn)的功能位點(diǎn)。HLA-Ⅱ類基因區(qū)靠近染色體著絲點(diǎn)，包括DR、DQ、DP、DN、DO、DM 6 個(gè)亞區(qū)，其中DR 亞區(qū)有1 個(gè)α 基因和4 個(gè)β 基因，分別編碼α 和β 鏈，兩者具有相近的分子量，可形成異二聚體，表現(xiàn)出不同的DR 抗原特異性[8]。HLA-DR 抗原具有多態(tài)性，HLADRB1 的等位基因超過460 種[9]。某個(gè)特定個(gè)體肯定具有HLA-DRB1基因的表達(dá)，但不一定有DRB2-DRB9基因的表達(dá)，因此對DR 位點(diǎn)的分型是集中在編碼DR抗原的主導(dǎo)DRB1 位點(diǎn)的分型[10]。HLA-DR可能直接作為免疫基因，降低孕婦對胎兒組織抗原的遞呈及識別能力，造成封閉抗體產(chǎn)生不足[11]。

HLA-DR等位基因產(chǎn)物的表達(dá)有共顯性特點(diǎn)，即同源染色體對應(yīng)座位上的2 個(gè)等位基因皆能得到表達(dá)[12-13]。HLA-I 類分子分布于所有有核細(xì)胞表面，HLA-Ⅱ類基因編碼的抗原僅分布于淋巴樣組織中的各種細(xì)胞表面，如B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的T 細(xì)胞，其功能是將外源性抗原肽遞呈給CD4 陽性T 細(xì)胞。HLA 是誘發(fā)同種異體排斥反應(yīng)的主要抗原，也是參與抗原提呈的關(guān)鍵分子。目前HLA 分型技術(shù)廣泛應(yīng)用于器官移植和骨髓移植時(shí)供者和受者組織相容性的配型[14-15]。移植排斥反應(yīng)發(fā)生與否及其反應(yīng)的強(qiáng)弱，關(guān)鍵取決于供、受者間組織相容性抗原的差異程度，即供受者間HLA 匹配的程度。經(jīng)典的器官移植國際通用配型標(biāo)準(zhǔn)源于美國器官分享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)（united network for organ sharing,UNOS），即HLA-A、B、DR 6 抗原配型標(biāo)準(zhǔn)。若供者和受者的HLA-A、B、DR 位點(diǎn)相容性高，則移植成功的可能性越大，其中HLA-DR 的作用最為重要[16-17]。結(jié)合器官移植國際通用HLA-A、B、DR 6 抗原配型標(biāo)準(zhǔn)和HDP 患者胎盤的超微病理學(xué)分析結(jié)果，可認(rèn)為妊娠這一半自體移植是否產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致HDP 發(fā)生和HLA-DR位點(diǎn)是否相容密切相關(guān)。張展等[18]研究顯示，子癇前期組母嬰同時(shí)攜帶HLADRB1*14 基因的頻率低于正常晚孕組。本研究HDP 組和對照組的HLA-DRB1 等位基因，母嬰HLA-DRB1 共享按抗原、等位基因及個(gè)數(shù)比較均無差異，該結(jié)果由于樣本量有限，其結(jié)論有一定局限性。無法提示HLA-DRB1 的母嬰相容性與HDP是否存在確切相關(guān)性。

綜上所述，海南地區(qū)HDP 病患者母嬰HLA-DRB1 基因共享率相對健康孕婦無明顯異常。