不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量研究

楊 雁，石 瑤，田 浩，楊天梅，左智天，袁理春，金 航

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】滇龍膽(Gentianarigescens)又稱滇龍膽草、堅(jiān)龍膽，屬于龍膽科( Gentianaceae ) 龍膽屬(GentianaLinn.)多年生草本植物，主要分布于四川、貴州、湖南、云南等地，是中國重要的資源植物[1]，云南是其主要的產(chǎn)區(qū)。滇龍膽被歷版《中國藥典》收錄，為傳統(tǒng)中藥龍膽的基源植物，在云南有著悠久的藥用歷史，其具有瀉肝膽火和除下焦?jié)駸岬裙π2]。近年來研究表明滇龍膽含有裂環(huán)烯醚萜、環(huán)烯醚萜、龍膽苯甲酸酯等多類成分，其中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷具保肝、護(hù)肝活性[3]，是滇龍膽主要的有效成分?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著藥廠對滇龍膽的需求量日益增加，有限的野生滇龍膽資源已滿足不了現(xiàn)代市場對滇龍膽藥材的需求，經(jīng)過多年的試驗(yàn)研究，目前，滇龍膽已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人工規(guī)?；N植，在云南省臨滄云縣、永德等地是其主要道地產(chǎn)區(qū)[4]。關(guān)于林藥復(fù)合種植的研究目前主要集中在其生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益[5-7]，課題成員對林藥復(fù)合種植模式下藥用植物有效成分含量變化也開展了很多的研究工作，但選擇的復(fù)合種植模式比較單一，種類比較少[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究選取7種常見的滇龍膽林藥復(fù)合種植模式作為研究對象，采用超聲波提取法，利用高效液相色譜測定7種林藥復(fù)合栽培模式下滇龍膽植株中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、和當(dāng)藥苷4種有效成分含量，依據(jù)測定結(jié)果對不同種植模式滇龍膽有效成分進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對不同林藥復(fù)合栽培模式下滇龍膽植株中有效成分的測定，探討不同種植模式滇龍膽中有效成分的積累特征，以期為滇龍膽林藥復(fù)合種植適應(yīng)性及栽培管理提供理論依據(jù)。

表1 不同林藥復(fù)合種植模式下滇龍膽生境條件Table 1 Habitat conditions of Gentiana rigescens under different intercropping patterns

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品于2016年11月采集自云南省臨滄市云縣，采樣區(qū)域生長海拔相近，選取7種滇龍膽復(fù)合種植模式：包括滇龍膽與木果石櫟、尼泊爾榿木、核桃樹、桉樹、杉木、木瓜和茶樹復(fù)合種植。依照5點(diǎn)采樣法采樣，每種復(fù)合種植模式的樣地面積為48 m2，分別采集滇龍膽60株，種植時(shí)間均為3年。每種種植模式隨機(jī)選取10株滇龍膽樣品，去除泥土，取根莖部位，將樣品置于100 ℃的烘箱殺青后置于70 ℃條件下烘干至恒重，粉碎，過60目篩，避光保存?zhèn)溆?。不同林藥?fù)合種植模式下滇龍膽生境條件見表1。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)儀器：LC-10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)：SPD-M10Avp二級管陣列檢測器， 7725i手動(dòng)進(jìn)樣器；萬分之一電子分析天平(美國奧豪斯)；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)； VE-A超純水機(jī)(深圳宏森環(huán)?？萍加邢薰?；FRQ-型超聲波清洗儀(杭州法蘭特超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

實(shí)驗(yàn)試劑：對照品購自中國食品藥品檢定研究院(龍膽苦苷110730-201315，馬錢苷酸111765-201402，獐牙菜苦苷110765-201303，當(dāng)藥苷114742-201131)；乙腈為色譜純；水為超純水；甲酸為分析純。

1.3 色譜條件

島津Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.1 %甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～5 min，5 % B；5～10 min，5 %～10 % B；10～26 min，10 %～26 % B；26～30 min，26 %～35 % B)，流速1.00 mL/min，檢測波長241 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液制備 精密稱取龍膽苦苷38.0 mg、馬錢苷酸10.0 mg，獐牙菜苦苷8.0 mg，當(dāng)藥苷7.5 mg對照品溶液，分別用甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得到對照品儲備溶液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取各對照品儲備液1 mL，于10 mL容量瓶中混合均勻，用甲醇定容至刻度，得混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。?.3 色譜條件進(jìn)樣，得色譜圖(圖1)。

1：馬錢苷酸；2：獐牙菜苦苷；3：龍膽苦苷；4：當(dāng)藥苷1: Loganic acid; 2: Swertiamarin; 3: Gentiopicroside; 4: Sweroside圖1 混合對照品圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard samples

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱取0.2 g樣品粉末于10 mL具塞試管中，加入10.00 mL 35 %乙醇溶液，超聲提取50 min，待溶液冷卻至室溫后稱重，甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微膜過濾，取濾液得供試樣品溶液。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別吸取10 μl進(jìn)樣。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，見表2。

1.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液各10 μl，在1.3色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積，RSD值分別為龍膽苦苷0.85 %、馬錢苷酸0.92 %、獐牙菜苦苷1.08 %、當(dāng)藥苷1.29 %，表明儀器精密度良好。

1.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取各6份，依照1.4.2的方法制備供試品溶液，在1.3色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算峰面積RSD值分別為1.12 %、2.05 %、1.85 %和2.24 %，表明供試品溶液重復(fù)性良好。

1.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一滇龍膽樣品0.2 g，依照1.4.2的方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 內(nèi)記錄峰面積，計(jì)算RSD值分別為0.73 %、1.05 %、1.21 %和1.93 %，表明在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.5.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取0.2 g已知含量的滇龍膽樣品(3次重復(fù))，分別按高(120 %)中(100 %)低(80 %)濃度加入4種對照品，依照1.4.2的方法制備供試品溶液，在1.3色譜條件下測定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示4種有效成分的平均回收率分別為100.41 %、96.03 %、96.5 %和97.9 %，表明此方法準(zhǔn)確度較高(表3)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 七種林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量及方差分析

由表4可知，滇龍膽中馬錢苷酸的含量在滇龍膽-核桃復(fù)合種植模式下最高(9.74 mg/g)，在滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式下最低(5.78 mg/g)，滇龍膽-核桃復(fù)合種植模式下馬錢苷酸的含量顯著高于其它6種復(fù)合種植模式。滇龍膽中獐牙菜苦苷的含量在滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式下的含量最高(10.82 mg/g)，在滇龍膽-茶樹復(fù)合種植模式下的含量最低(8.25 mg/g)，滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式下獐牙菜苦苷的含量顯著高于滇龍膽-茶樹、滇龍膽-尼泊爾榿木、滇龍膽-木瓜復(fù)合種植模式，其余種植模式差異不顯著。滇龍膽中龍膽苦苷的含量在滇龍膽-尼泊爾榿木復(fù)合種植模式下最高(85.99 mg/g)，在滇龍膽-杉木復(fù)合種植模式下最低(49.55 mg/g)，滇龍膽-尼泊爾榿木復(fù)合種植模式下龍膽苦苷含量除與滇龍膽-桉樹復(fù)合種植模式差異不顯著外，與其它5種復(fù)合種植模式龍膽苦苷含量差異顯著。滇龍膽中當(dāng)藥苷的含量在滇龍膽-杉木復(fù)合種植模式下的含量最高(2.05 mg/g)，在滇龍膽-木瓜復(fù)合種植模式下的含量最低(1.5 mg/g)，7種復(fù)合種植模式當(dāng)藥苷的含量差異均不顯著。

表2 回歸方程與線性范圍Table 2 Linear relations and linear ranges

表3 回收率實(shí)驗(yàn)Table 3 Recovery experiment

方差分析結(jié)果表明：不同林藥種植模式對滇龍膽根莖中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐芽菜苦苷含量有顯著影響。

2.2 不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分的相關(guān)性分析

不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分的相關(guān)性分析(表5)結(jié)果顯示，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量呈極顯著正相關(guān)(R=0.35，P< 0.01)，當(dāng)藥苷分別與馬錢苷酸和獐牙菜苦苷含量呈極顯著正相關(guān)(R=0.49，P< 0.01；R=0.41，P< 0.01)。

表4 不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量的比較Table 4 Comparison of effective components of Gentiana rigescens from different intercropping patterns

注：同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note: Different lowercase in same column indicates significant difference (P<0.05).

表5 不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of effective components of Gentiana rigescens from different intercropping patterns

注：**表示在P< 0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。
Note: ** means significant correlation atP< 0.01 level.

3 討 論

光是影響植物次生代謝產(chǎn)物形成的重要環(huán)境因素[11]，研究表明藥用植物藥效成分的產(chǎn)生和積累受生態(tài)環(huán)境因素的影響，光照、水肥條件等對藥用植物的有效成分也有影響[12～13]。研究發(fā)現(xiàn)不同光照條件下三花龍膽(GentianatrifloraPall.) 中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的含量有顯著變化，因此不同顏色和波長范圍的光照可影響植株體內(nèi)化學(xué)成分的變化[14]。在7種林藥復(fù)合種植模式，尼泊爾榿木和木果石櫟均為高大喬木，株高可達(dá)15～30 m，林冠稀疏，因此在尼泊爾榿木和木果石櫟復(fù)合種植下的滇龍膽生境條件光照十分充足，滇龍膽植株生長較好；與茶樹套種，茶樹比較低矮，株高低于1.5 m，種植區(qū)域均為臺地茶，行間距在1 m左右，生境條件光照不充足，不利于滇龍膽生長；核桃樹、木瓜株高有3～5 m，但這兩種樹種枝葉比較稠密，套種在這兩種模式林下光照條件較差；桉樹為高大喬木，根系發(fā)達(dá)，蒸騰作用比較強(qiáng)，對土壤水分需求量較高，對土壤養(yǎng)分需求量巨大，不利于其他植物生長，因此滇龍膽-桉樹復(fù)合種植條件下，滇龍膽植株生長情況也不是太好；杉木為高大喬木，對滇龍膽生境條件光照影響較小，但杉木對土壤水分和養(yǎng)分需求量較高，根系比較淺，側(cè)根、須根發(fā)達(dá)，與滇龍膽根系生長的耕層土壤在同一區(qū)域，也不利于滇龍膽根系的生長。

這7種復(fù)合種植模式下滇龍膽有效成分測定結(jié)果顯示，滇龍膽與尼泊爾榿木復(fù)合種植植株有效成分總含量最高，與木果石櫟復(fù)合種植滇龍膽植株有效成分總含量次之，與杉木復(fù)合種植有效成分總含量最低。有研究顯示不同的栽培模式改變了植物生長的環(huán)境，對植物生長產(chǎn)生特定的刺激，最終造成其質(zhì)量的差別[15]；在光照強(qiáng)度較高的生境中藥材有效成分含量高于光照強(qiáng)度較低的生境[16]；適宜的間作復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)可以改善生態(tài)環(huán)境小氣候。

4 結(jié) 論

通過對7種不同林藥復(fù)合種植模式滇龍膽有效成分含量進(jìn)行分析，滇龍膽所處的生境不同，所接受的光照、溫度、水分等也不同，加之植物之間的化感作用，滇龍膽有效成分含量差異顯著，滇龍膽不同林藥復(fù)合種植模式下有效成分含量變化可能與其生長的微環(huán)境有關(guān)，還需從植物學(xué)、植物生理學(xué)、栽培學(xué)等方面進(jìn)行深入研究，為提高滇龍膽藥材品質(zhì)及復(fù)合生態(tài)種植技術(shù)提供指導(dǎo)性數(shù)據(jù)。