凡納濱對蝦爛尾病病原的分離鑒定及藥敏分析

黃雪敏，梁華芳，薛 明，余文智，李成聰，陳 耀，溫崇慶

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凡納濱對蝦爛尾病病原的分離鑒定及藥敏分析

黃雪敏，梁華芳，薛 明，余文智，李成聰，陳 耀，溫崇慶

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【目的】研究廣東湛江地區(qū)凡納濱對蝦（）爛尾病主要病原及其藥敏特征?！痉椒ā繌膶ξr病灶部位分離純化細菌，用2株代表菌株對健康蝦進行創(chuàng)傷浸浴感染試驗，分析菌株形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA和基因序列，以哈維氏弧菌（）和坎氏弧菌（.）溶血素基因特異引物擴增菌株基因組DNA，通過紙片擴散法測試菌株對17種藥物的敏感性。【結(jié)果】從患病親蝦和養(yǎng)殖對蝦分別分離獲得編號2018B22和2018MZ1的代表菌，兩株菌16S rRNA和基因序列均與哈維氏弧菌最相似，且均可被哈維氏弧菌溶血素基因引物特異擴增，表型特征亦與哈維氏弧菌相近；兩株菌均可引起凡納濱對蝦爛尾病，其中菌株2018B22的致病力較2018MZ1更強，而后者的耐藥譜更廣?！窘Y(jié)論】湛江地區(qū)凡納濱對蝦爛尾病主要病原為哈維氏弧菌。

凡納濱對蝦；爛尾??；哈維氏弧菌；鑒定；藥敏試驗

凡納濱對蝦（）是我國乃至世界最主要養(yǎng)殖蝦種。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，細菌性病害頻發(fā)，給凡納濱對蝦產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。對蝦細菌性病害多由弧菌引發(fā)，從孵化期到成蝦均經(jīng)常發(fā)生，主要包括黃鰓病、黑鰓病、紅腿病、肌肉白濁病、白黑斑病、幼體發(fā)光病及敗血癥[1-2]，以及急性肝胰腺壞死綜合征等[3]。已報道的對蝦弧菌病病原有哈維氏弧菌（）、副溶血弧菌（）、坎氏弧菌（）和溶藻弧菌（）等[1-3]十多種。

對蝦爛尾病在養(yǎng)殖生產(chǎn)中雖時有發(fā)生，但僅林延川等[4]簡要介紹凡納濱對蝦爛尾病病癥、可能原因和治療措施，鮮見該病病原及其藥物敏感方面的報道。2018年4―7月，廣東湛江地區(qū)一些凡納濱對蝦繁育場的親蝦及養(yǎng)殖場的對蝦在養(yǎng)成期間出現(xiàn)大批爛尾現(xiàn)象，其中親蝦發(fā)病癥狀比養(yǎng)殖對蝦更為嚴重，甚至造成大量親蝦死亡。本研究針對湛江地區(qū)出現(xiàn)的凡納濱對蝦爛尾病開展細菌分離鑒定、致病性和藥物敏感性研究，為對蝦爛尾病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對蝦 患病凡納濱對蝦親蝦和養(yǎng)殖對蝦分別取自廣東湛江市徐聞縣某對蝦繁育場和湛江市麻章區(qū)某對蝦養(yǎng)殖場，親蝦體質(zhì)量（35.4±5.2）g，養(yǎng)殖期對蝦體質(zhì)量（4.8±0.5）g。發(fā)病對蝦主要癥狀為腹部最后2體節(jié)、尾扇有多處發(fā)黑病灶，尾扇腫脹、邊緣潰爛，甚至因潰爛導(dǎo)致尾扇殘缺（圖1）。發(fā)病初期對蝦活力和攝食正常，癥狀嚴重時游動和攝食明顯減少，活力下降。

攻毒用健康凡納濱對蝦取自湛江市東海島廣東海洋大學(xué)養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖對蝦，體質(zhì)量（0.9±0.4）g。

1.1.2 試劑、引物和菌株 2216E瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g，酵母粉 1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，瓊脂粉 18 g，陳海水 1 L，pH 7.6 ~ 7.8；TCBS瓊脂培養(yǎng)基（CM402），北京陸橋技術(shù)公司產(chǎn)品；MH瓊脂培養(yǎng)基（B163）和藥物紙片為杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。API 20E生化鑒定試劑條及其配套試劑，梅里埃公司產(chǎn)品；細菌DNA提取試劑盒（DP302），天根生化科技公司產(chǎn)品；Taq DNA 聚合酶（R001B）和pMD19-T載體（6013），Takara公司產(chǎn)品。所用引物均由上海生工生物公司合成。

箭頭示主要發(fā)病部位

The main infection focuses are indicated by arrows

圖1凡納濱對蝦親蝦（A）和養(yǎng)殖個體（B）爛尾病癥狀

Fig. 1 Symptoms of tail-rotted disease offrom broodstocks (A) and cultured individuals (B)

大腸桿菌（）DH5α和ATCC 25922為廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院微生物學(xué)實驗室保存，分別用于轉(zhuǎn)化實驗感受態(tài)細胞制備和藥敏試驗參考菌株。

1.2 病原菌分離

分別取有典型爛尾癥狀的凡納濱對蝦親蝦、養(yǎng)殖期對蝦各3尾，無菌海水沖洗蝦體3遍，用接種環(huán)蘸取尾扇病灶組織分別于2216E及TCBS瓊脂平板上劃線，于30℃條件下培養(yǎng)2 d，取優(yōu)勢菌落于2216E平板純化，獲得純培養(yǎng)斜面后加石蠟油于15℃下保存，備用。

1.3 人工感染

選取暫養(yǎng)2 d的無外傷、活力強的健康凡納濱對蝦進行人工浸浴感染試驗。分別取分離自發(fā)病親蝦和養(yǎng)殖對蝦的代表菌各1株，用2216E培養(yǎng)基在30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，用無菌海水漂洗2次，用無菌海水將細菌稀釋至1×1010cfu/mL。試驗設(shè)2個感染組及1個對照組，每組設(shè)3個重復(fù)組，在25 L食品級塑料桶中進行。每桶含經(jīng)體積分數(shù)20×10-6甲醛消毒12 h，再曝氣處理24 h的海水10 L，投放被無菌針扎刺尾扇兩次的對蝦10尾。感染組分別加入相應(yīng)的菌懸液5 mL，每天1次，連續(xù)4 d；對照組不加菌。試驗期間連續(xù)充氣，日換水20%，每8 h投喂配合飼料1次，室溫（24～27℃）下養(yǎng)殖10 d，每天觀察記錄各組對蝦發(fā)病情況，試驗結(jié)束時對感染發(fā)病對蝦進行病原菌再分離。

1.4 細菌鑒定

1.4.1 形態(tài)和生化試驗 將兩株代表菌分別于2216E和TCBS瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)（30℃），觀察記錄菌落特征。按常規(guī)方法對兩株菌進行革蘭染色和細胞大小測定，生理生化試驗主要采用API 20E生化鑒定試劑條按其使用說明操作，同時測定兩株菌對弧菌抑制菌0/129的敏感性。

1.4.2 16S rRNA和基因測序和分析 按操作說明提取兩株菌的基因組DNA。以引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對兩株菌進行16S rRNA基因PCR擴增，參考文獻[5]方法，以引物H60F[6]（5′-GGNGAYGGNACNACNACN GCN CANGT-3′）和H60R（5′-TCNCCRAANCCNGGN GCYTTNACNGC-3′）進行基因擴增。PCR反應(yīng)體系均為50 μL，含10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）各1 μL，引物（20 μmol/L）0.5 μL，基因組DNA 5 μL（約25 ng），Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，以ddH2O補足體積。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。對16S rRNA基因擴增產(chǎn)物純化后直接通過27F和1492R引物雙向測序，再拼接完整；基因擴增產(chǎn)物純化后通過pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行目的片段測序。測序均委托華大基因廣州分公司通過ABI 3730XL測序儀完成。

將測得的16S rRNA基因序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫（https://www.ezbiocloud.net/）模式菌株進行比對，以確定其可能種屬信息。對于基因序列，通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列比對，從中調(diào)取與代表菌株最相似幾種弧菌尤其是模式菌株HSP60序列，用MEGA 7軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 溶血素（）基因檢測 參考Haldar等[7]方法，分別以哈維氏弧菌溶血素基因特異性引物（Vh-hly1F：5′-GAGTTCGGTTTCTTTCAAG-3′，Vh-hly1R：5′-TGTAGTTTTTCGCTAATTTC-3′）和坎氏弧菌溶血素基因特異性引物（Vca-hly5：5′-CTATTGGTGGAACGCAC-3′，Vca-hly3：5′-GTA TTCTGTCCATACAAAC-3′），對兩株代表菌基因組DNA進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.5 藥敏試驗

參考曾德乾等[8]方法，用紙片擴散法（Kirby-Bauer法），以大腸桿菌ATCC 25922為參考菌株，檢測兩株代表菌對17種藥物的敏感性。取100 μL 濃度約108cfu/mL菌懸液涂布于含20 mg/mL NaCl的MH瓊脂平板，貼上藥敏紙片，每株菌每種試紙做2次重復(fù)，于28℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑，取平均直徑，參考文獻[9]方法判定測試菌株的藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離

從患病親蝦（圖1A）和養(yǎng)殖對蝦（圖1B）各分離到一株優(yōu)勢代表菌，分別編號為2018B22和2018MZ1。

2.2 人工感染

分離菌株2018B22和2018MZ1均可引起凡納濱對蝦爛尾病，發(fā)病率分別為（40±10）%、（16.7±11.5）%，其中2018B22感染組不僅發(fā)病率較高，發(fā)病對蝦爛尾程度較嚴重，有2尾對蝦嚴重感染死亡；2018MZ1感染組發(fā)病個體爛尾癥狀相對較輕，試驗期間無死亡個體；而對照組在試驗后期僅有1尾對蝦尾扇表現(xiàn)輕微癥狀。從感染組病蝦尾扇處再次分離到與實驗菌株特征一致的菌株，表明菌株2018B22和2018MZ1為爛尾病的病原菌。

2.3 細菌鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 分離菌株2018B22和2018MZ1均為革蘭陰性，短桿狀，分散排列，可運動，細胞大小分別為（0.5 ~ 0.9）μm ×（0.9 ~ 2.8）μm和（0.4 ~ 0.8）μm × （0.8 ~ 1.7）μm。2018B22和2018MZ1在2216E平板30℃下培養(yǎng)24 h的菌落均為圓形、表面光滑、濕潤、淡黃色，直徑分別約為1.8 ~ 2.5 mm和4 ~ 5 mm；在TCBS平板菌落均為圓形、較光滑、黃色、邊緣規(guī)整，直徑1 ~ 2 mm。兩株菌在2216E和TCBS平板上的菌落均無可見熒光。

2.3.2 生理生化特征 菌株2018B22和2018MZ1對弧菌抑制菌0/129（150 μg /片）均顯示敏感但敏感性較弱。表1可見，2株菌20項生化試驗結(jié)果均一致。與弧菌科菌種[10]相關(guān)特征相比，兩株菌生理生化特征與哈維氏弧菌均較一致。

表1 菌株201B22和2018MZ1的API 20E試驗結(jié)果

注：＋、－、d、NO 分別表示陽性、陰性、可疑和無記錄。

Note: ＋, －, d , and NO indicate positive, negative, dubious results, and no data, respectively.

2.3.3 16S rRNA基因序列分析 菌株2018B22和2018MZ1的16S rRNA基因測序拼接后有效序列長度分別為1 424、1 399 bp，兩者僅有2個堿基差異，GenBank登錄號分別為MK318662和MK318661。EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，菌株2018B22和2018MZ1的16S rRNA基因均與哈維氏弧菌模式菌株NBRC 15634T最相似，但分別與表2的其他弧菌模式菌株的相似性也較高（≥98.5%）。

表2 菌株201B22和2018MZ1與模式菌株16S rRNA基因序列的相似性

2.3.4基因序列分析 兩株菌基因經(jīng)克隆子測序后，有效序列均為541 bp，兩者有6個堿基差異，相似性98.89%。NCBI 比對顯示兩株菌均與包括模式菌株在內(nèi)的多株哈維氏弧菌基因序列相近，相似性均超過98.7%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一獨立分支（圖2），并與其他幾種弧菌明顯分開，與其序列相似性均不到97.5%。從基因同源性上看，2018B22和2018MZ1極可能是哈維氏弧菌。

2.3.5基因檢測 圖3可見，哈維氏弧菌基因特異引物對兩株菌均擴增出約500 bp特異條帶，與目的片段大小一致，而坎氏弧菌基因特異引物除從陽性對照擴增出約300 bp目的片段外，對兩株菌的擴增結(jié)果均為陰性，進一步表明兩株菌極可能是哈維氏弧菌，排除為坎氏弧菌的可能。綜合形態(tài)和生理生化特征、16S rRNA與基因測序分析和基因檢測結(jié)果，確定菌株2018B22和2018MZ1均為哈維氏弧菌。

2.4 藥敏試驗

如表3所示，在17種抗菌藥物中，菌株2018B22對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素等8種藥物表現(xiàn)敏感，對氨芐青霉素等4種藥物呈耐藥性；菌株2018MZ1僅對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素表現(xiàn)敏感，對呋喃唑酮等8種藥物呈耐藥性?？梢妰芍昃鷮λ幬锩舾行杂休^大差異，但均對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素敏感，同時均對氨芐青霉素、阿莫西林、多黏菌素B和四環(huán)素表現(xiàn)耐藥性。

括號內(nèi)為序列在GenBank中的登錄號The sequences accession numbers in GenBank were shown in parentheses

M: DNA標(biāo)準；1-3分別為Vh-hly引物擴增陰性對照、2018MZ1和2018B22；4-7分別為Vca-hly引物擴增產(chǎn)物陰性對照、2018MZ1、2018B22和陽性對照

M: DNA marker; 1-3 indicated the amplification of negative control, 2018MZ1, and 2018B22 with Vh-hly primers, respectively; 4-7 indicated the amplification of negative control, 2018MZ1, 2018B22, and positive control with Vca-hly primers, respectively

圖3基因PCR擴增產(chǎn)物

Fig. 3 PCR amplified products of hly gene

3 討論

迄今，鮮見有關(guān)對蝦爛尾病的報道，尤其缺乏該病病原的資料。本研究凡納濱對蝦爛尾病癥狀與林延川等[4]報道的相似。林延川等[4]認為其病因是水質(zhì)惡化和對蝦體質(zhì)下降時細菌感染所致，但具體病原未作描述。本研究表明，2018年春夏季湛江地區(qū)凡納濱對蝦爛尾病主要由哈維氏弧菌引起，但兩株病原菌的致病力不同，其中親蝦分離株致病力明顯強于養(yǎng)殖對蝦分離株，與其最初分離病蝦的爛尾程度一致。哈維氏弧菌是海產(chǎn)動物最常見病原菌之一，也是條件致病菌，廣泛分布于海水養(yǎng)殖環(huán)境，可引起對蝦多種病癥[2, 11-12]。哈維氏弧菌對水產(chǎn)動物的致病機制目前還不完全清晰，但其溶血素、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等胞外產(chǎn)物被認為是重要毒力決定因子[11]。細菌毒力基因表達水平會隨環(huán)境條件而變化，Montánchez等[13]研究表明，溫度升高促進了哈維氏弧菌毒力基因表達并增強其致病性。本研究和林延川等[4]報道的凡納濱對蝦爛尾病均發(fā)生在夏季，夏季養(yǎng)殖水溫升高極可能與該病發(fā)生密切相關(guān)，具體致病機制仍需進一步研究。

表3 藥敏試驗結(jié)果

注：R，耐藥；I，中介；S，敏感

Notes: R, Resistant；I, Intermediate；S, Sensitive

哈維氏弧菌通?？砂l(fā)熒光[10-11]，引起對蝦病害的哈維氏弧菌多數(shù)情況下可發(fā)熒光[11, 14]，但本研究兩株分離菌菌落均未發(fā)熒光。Defoirdt等[15]發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌不同菌株間熒光強弱差異明顯，但與其對鹵蟲（）幼體毒性關(guān)系不大。Zhou等[14]從患白尾病的凡納濱對蝦病灶中分離到一株高毒力非熒光的哈維氏弧菌?？梢姽S氏弧菌致病性強弱與其是否發(fā)光與并無直接關(guān)系。

細菌的準確鑒定需結(jié)合表型和分子特征。本研究中，兩株分離菌的細胞和菌落大小均略有不同，兩株菌的致病力差異較大，但表型上均與哈維氏弧菌相近。細菌分子鑒定中最常用方法是16S rRNA基因序列分析，16S rRNA基因進化保守，可對細菌進行屬水平上的鑒定。本研究中，二菌株與包括哈維氏弧菌在內(nèi)的多種弧菌16S rDNA序列相似性均達98.5%以上，仍需借助其他方法進一步鑒定。哈維氏弧菌與坎氏弧菌常引起對蝦病害[2, 11-12]，兩者表型與基因型特征較相似，常被相互錯誤鑒定[2,10,12]。基因編碼細菌60 ku熱休克蛋白，在細菌基因組中常以單拷貝存在，進化速度快于16S rRNA基因，適用于鑒別親緣關(guān)系相近的細菌[5]。本研究兩株分離菌基因序列均與哈維氏弧菌的最為相似，系統(tǒng)進化樹上聚為一類，與包括坎氏弧菌在內(nèi)的其他弧菌模式菌株明顯分開，序列相似性也較低，可見基因序列可有效區(qū)分親緣關(guān)系相近的弧菌?；蛟谕N弧菌中具高度保守性，可用于弧菌種水平上的特異性檢測[5-6]，本研究兩株分離菌均可被哈維氏弧菌基因引物擴增，而未被坎氏弧菌引物擴增，進一步明確兩株菌是哈維氏弧菌，而排除坎氏弧菌的可能性。

本研究鑒定的兩株哈維氏弧菌可能因分離源不同，對抗菌藥物的敏感性有較大差異，但兩者均對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素敏感，而對氨芐青霉素、阿莫西林、多黏菌素B和四環(huán)素耐藥。童國忠等[16]、梅冰等[17]和姚歡等[18]分別報道了海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚（）（浙江舟山）、斜帶石斑魚（）（海南三亞）和眼斑擬石首魚（）（廣東湛江）爛尾病的病原均為哈維氏弧菌，這些病原菌菌株除對四環(huán)素敏感性不一致外，對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素均表現(xiàn)敏感，而對氨芐青霉素、阿莫西林和多黏菌素B有耐藥性。劉迪等[19]對10株分離自上海、浙江、福建和海南養(yǎng)殖凡納濱對蝦的哈維氏弧菌藥敏試驗結(jié)果也與此一致。曾德乾等[7]對源自南海沿岸患病魚類的84株哈維氏弧菌耐藥性測試也獲得相似結(jié)果，所有菌株均對諾氟沙星敏感，對復(fù)方新諾明和氯霉素表現(xiàn)敏感的菌株也分別約占90%和80%，對阿莫西林耐藥率高達90.5%。以往研究和本研究均表明，中國東南沿海不同時空養(yǎng)殖環(huán)境分離的多數(shù)哈維氏弧菌對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素敏感，而對阿莫西林、氨芐青霉素和多黏菌素B呈現(xiàn)耐藥性。盡管本研究兩株哈維氏弧菌均對諾氟沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素敏感，且菌株2018B22還對另外5種藥物敏感，然而這些敏感藥物目前均為漁業(yè)禁藥。因此，對哈維氏弧菌所致對蝦爛尾病或其他水產(chǎn)病害的防治，在保持良好養(yǎng)殖環(huán)境的同時，需探索非藥物的綠色途徑。

綜上，本研究結(jié)合表型和分子方法確定，2018年春夏季湛江地區(qū)凡納濱對蝦爛尾病主要病原為非發(fā)光哈維氏弧菌，兩株不同分離源哈維氏弧菌的致病力和藥物敏感性均呈現(xiàn)明顯差異。這些結(jié)果可為對蝦爛尾病的研究和防治提供參考依據(jù)。

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Identification and DrugSensitivity Test of Pathogen Isolated fromAssociated with Tail-Rotted Disease

HUANG Xue-min, LIANG Hua-fang, XUE Ming, YU Wen-zhi, LI Cheng-cong, CHEN Yao, WEN Chong-qing

（,,524088,）

【Objective】To study the main pathogen and drug sensitivity associated with tail-rotted disease ofin Zhanjiang, Guangdong Province. 【Methods】Bacteria were isolated from lesion locations of the diseased shrimps, and two representative strains were first tested for artificial infection of healthy shrimps by wound immersion. Then they were identified by morphological, physiological and biochemical characteristics, and were further studied by sequencing analysis of 16S rRNA and HSP60 genes, as well as amplifying with hemolysin gene-specific primers forand. Finally, the sensitivities of the strains to 17 kinds of drugs were examined by disc diffusion method. 【Results】Two representative strains, 2018B22 and 2018MZ1, were isolated from the diseased broodstock and cultured individually. They were most phylogenetically affiliated with.based on sequence similarity of 16S rRNA and HSP60 genes, and both of them could be specifically amplified by the hemolysin gene-specific primers of, and had similar phenotypic characteristicsto those of.. Both strains could cause tail-rotted disease of., and strain 2018B22 was more pathogenic than strain 2018MZ1, while the latter had a broader spectrum of drug resistance. 【Conclusion】was the main pathogen causing tail-rotted disease ofin the Zhanjiang area.

; tail-rotted disease;; identification; drug sensitivity test

S917.1; S945.1

A

1673-9159（2019）04-0042-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.007

2019-02-17

國家自然科學(xué)基金項目（31502189）；廣東海洋大學(xué)2019年度創(chuàng)新強校專項資金（230419095）

黃雪敏（1994—），女，碩士研究生，研究方向為海洋和水產(chǎn)微生物學(xué)。

溫崇慶（1974—），男，教授。 E-mail: chongqingwen@163.com

黃雪敏，梁華芳，薛明，等. 凡納濱對蝦爛尾病病原的分離鑒定及藥敏分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2019，39（4）：42-48.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）