非小細胞肺癌組織及細胞中IL-35的表達

張 玉，張城城,2，董利菊，沙 泉

隨著惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率的逐年增加，人類健康受到了嚴重威脅。肺癌已經(jīng)成為男性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。雖然肺癌的研究近年來已取得一定進展，但是非小細胞肺癌(non-small lung cancer,NSCLC)發(fā)現(xiàn)時多已處于中晚期，5年生存率并未顯著提高[2]。白細胞介素35(interleukin-35，IL-35)是新發(fā)現(xiàn)的白細胞介素12(interleukin-12，IL-12)家族成員，由EB病毒誘導(dǎo)基因3(epstein-barr virus-induced gene 3，EBI3)和P35組成的異源二聚體，主要在免疫細胞中表達[3]。研究[4-6]顯示，IL-35在肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中高表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移。但IL-35在NSCLC中的表達情況知之甚少。該研究擬通過分析IL-35在NSCLC中的表達和與患者預(yù)后的關(guān)系，以及對肺癌細胞生物學(xué)功能的影響，闡明IL-35在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的可能作用，為肺癌的靶向治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科2015年1～12月的74例NSCLC患者石蠟包埋的肺癌組織，被研究者臨床資料完整，手術(shù)前均未行放化療。NSCLC患者男47例，女27例；年齡43～84(61.31±8.49)歲，其中腺癌41例，非腺癌33例。根據(jù)國際肺癌TNM標準分期：T1+T2者55例，T3+T4者19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0+N1者54例，N2+N3者20例：遠處轉(zhuǎn)移 M0者65例，M1者9例。選擇同期入院治療的肺部良性病變患者石蠟包埋的肺組織25例，設(shè)為對照組，男14例，女11例；年齡21～68(45.92±15.06)歲，其中肺大皰7例，硬化性血管瘤5例，錯構(gòu)瘤4例，支氣管擴張4例，其他5例。

1.2 主要試劑免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購自臺灣GeneMark生物公司；逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自南京Vazyme公司；人肺腺癌細胞株A549、NCI-H1975和PC-9為本單位免疫學(xué)省級重點學(xué)科實驗室保存；正常人腎上皮細胞HEK293由安徽醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室饋贈；DMEM細胞培養(yǎng)基購自以色列BI公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CCK-8購自上海貝博生物公司；IL-35的亞基EBI3和P35抗體購自美國Abcam公司；人重組IL-35蛋白購自美國PeproTech公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化法檢測IL-35兩個亞基在NSCLC組織中的表達 采用SP法，以PBS代替一抗作陰性對照。首先組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精(100%、95%、75%)水化。檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)于高壓鍋中加熱煮沸，放入切片，蓋上壓力氣閥至噴氣后1～3 min進行抗原修復(fù)，3% H2O2孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗，然后一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色沖洗。最后蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢并拍照記錄。免疫組化結(jié)果判斷：本實驗采用許良中 等[7]的方法，根據(jù)細胞著色程度和陽性細胞占觀察細胞百分比的評分乘積進行半定量。隨機選取5個400倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，按著色程度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞占觀察細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽性(+)，6～8分為中度陽性()，>8分為強陽性()。其中-定義為蛋白陰性，+～定義為蛋白陽性。

1.3.2細胞培養(yǎng)與傳代 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，若為單層緊密狀態(tài)時，用EDTA-胰蛋白酶消化，收集對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.3RT-PCR法檢測細胞中IL-35亞基表達水平 分別收集對數(shù)生長期的A549、NCI-H1975、PC-9和HEK293細胞，提取總RNA作為模板并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA進行RT-PCR。EBI3：上游引物：5′-CCTTCATTGCCACGTACAGG-3′，下游引物：5′-GGGCTTGATGATGTGCTCTG-3′，擴增長度為206 bp；P35：上游引物： 5′-TCAGAATTCGGGCAGTGACT-3′，下游引物： 5′-AGTCCCATCCTTCTTTCCCC-3′，擴增長度為163 bp。內(nèi)參為β-actin,PCR反應(yīng)預(yù)變性溫度：95 ℃、5 min,1個循環(huán)。循環(huán)反應(yīng)溫度:95 ℃,10 s;60 ℃,30 s,40個循環(huán)。溶解曲線溫度:95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s，1個循環(huán)。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的A549細胞，計數(shù)細胞：每100 μl細胞數(shù)為2 000～5 000個，加入到96孔板中，待細胞貼壁，分別用2、10、50 ng/ml的IL-35刺激48 h后，每孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，于酶標儀450 nm 波長處測吸光度(A)值。

1.3.5劃痕實驗和Transwell小室測細胞遷移侵襲能力 劃痕實驗：取對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化，在6孔板中加入5×105個細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜。用無菌槍頭緩慢劃痕，用PBS清洗細胞2～3次去除浮起的細胞。對照組加入含0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基，IL-35組在加入含0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基的同時,加入50 ng/ml的IL-35,放入37 ℃培養(yǎng)，按0、12、24 h取樣，拍照。Transwell實驗：A549細胞用50 ng/ml的IL-35刺激24 h后，胰酶消化制成5×105個/ml的細胞懸液。在小室上層加入20 μl Matrigel覆蓋整個聚碳酸酯膜后自然晾干。下層加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl,上層加入200 μl不含血清的A549細胞懸液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，顯微鏡下拍照計數(shù)。

圖1 NSCLC和肺部良性病變組織中EBI3和P35的表達

2 結(jié)果

2.1 IL-35在NSCLC組織中的表達免疫組化連續(xù)切片法染色結(jié)果顯示，NSCLC組織中EBI3和P35的表達水平明顯高于肺部良性病變者(圖1)，且EBI3和P35在空間分布和表達水平上有很強的相關(guān)性(rs=0.770,P<0.001)，見表1，所以這兩者的表達可以代表IL-35的表達水平，將IL-35表達定義為EBI3和P35都為(/)，其余情況為IL-35不表達。免疫組化結(jié)果表明NSCLC組織中可能高表達IL-35。統(tǒng)計分析顯示，IL-35表達與腫瘤T分期(χ2=5.129，P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.761，P<0.01)呈正相關(guān)性，與患者性別(χ2=0.667，P>0.05)、年齡(χ2=0.746，P>0.05)、組織類型(χ2=1.66，P>0.05)、分化程度(χ2=0.688，P>0.05)及遠端轉(zhuǎn)移(P>0.05)等無相關(guān)性(表2)，以上結(jié)果提示：IL-35可能是肺癌的潛在標志物。

表1 IL-35兩個亞基在74例NSCLC中表達的相關(guān)性

*采用Spearman相關(guān)性分析

表2 IL-35表達與NSCLC病理特征的相關(guān)性(n)

2.2 IL-35亞基在肺癌細胞和HEK293中的表達以人腎上皮細胞HEK293為對照，通過RT-PCR法檢測IL-35亞基EBI3和P35在不同肺癌細胞系中的表達。結(jié)果顯示，IL-35亞基在肺癌細胞系A(chǔ)549、H9175、PC-9中的表達水平與人正常細胞HEK293細胞有差異(圖2)，表明IL-35可能在肺癌的進展中發(fā)揮重要作用。

圖2 EBI3和P35在不同肺癌細胞系和正常細胞中的表達

2.3 IL-35對A549肺癌細胞增殖的影響鑒于IL-35在A549細胞中表達量最高，且易培養(yǎng)，因此選擇A549細胞作為后續(xù)研究對象。不同濃度的人重組外源性IL-35蛋白作用于A549細胞48 h后，通過CCK-8法檢測顯示，50 ng/ml的IL-35可明顯促進A549肺癌細胞的增殖,與0 ng/ml比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖3。

圖3 不同濃度IL-35對A549細胞活力的影響

2.4 IL-35對A549細胞遷移和侵襲能力的影響采用劃痕實驗于0、12、24 h分別檢測50 ng/ml的IL-35對A549細胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，IL-35具有一定的促進肺癌細胞遷移的能力，與對照組比較，24 h后劃痕相對寬度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖4A、4B。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，IL-35具有一定的促進肺癌細胞侵襲的作用，與對照組比較，IL-35組侵襲細胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4C、4D。由此可推測IL-35可明顯促進A549細胞的遷移和侵襲。

3 討論

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌好發(fā)于支氣管黏膜上皮，病因至今尚不完全明確。隨著醫(yī)療水平的提高，肺癌的治療方法日益豐富，已發(fā)展成為手術(shù)為主，放療、化療和免疫治療等治療手段為輔的綜合性治療，但NSCLC確診時多已屬于晚期，總體預(yù)后情況仍不容樂觀[8-9]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療已成為腫瘤治療的研究熱點，而尋找有效的靶基因尤為重要。研究證實，白細胞介素能影響包括腫瘤細胞在內(nèi)的多種細胞的增殖、成熟、黏附及轉(zhuǎn)移等多方面生理過程。大量動物實驗結(jié)果顯示，IL-12對肝癌、腎細胞癌等多種癌癥具有防治效果，可增強免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。

IL-35是IL-12家族的最新成員，主要由Treg細胞分泌，在單核細胞、T細胞、B細胞及腫瘤細胞等多種類型細胞上表達，通過激活JAK-STAT信號通路參與免疫功能的調(diào)節(jié)，除了直接抑制腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫狀態(tài)，引起免疫逃逸，IL-35還能直接作用于某些腫瘤細胞促進腫瘤的進展[11]。Wang et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，IL-35在B細胞淋巴瘤、黑色素瘤及鼻咽癌等多種腫瘤組織和腫瘤細胞系中都有表達。有研究[13]證實IL-35在急性髓系白血病中，除了能誘發(fā)腫瘤的免疫逃逸機制外，也能直接促進腫瘤增殖及抑制腫瘤凋亡。一項NSCLC研究[14]顯示，NSCLC患者血漿IL-35水平較正常對照人群明顯升高，且血漿IL-35高表達水平與較差的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，單因素及多因素分析顯示血漿IL-35是NSCLC患者的獨立預(yù)后因素。由此可見，IL-35可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 IL-35對A549細胞遷移和侵襲的影響

A:顯微鏡下細胞遷移能力的差異×50；B：劃痕愈合的相對定量分析；與對照組比較：***P<0.001；C: 顯微鏡下細胞侵襲能力的差異×100；D：細胞侵襲數(shù)目的定量分析；與對照組比較：**P<0.01

本研究通過免疫組化法檢測NSCLC患者和對照組組織中IL-35的表達水平，結(jié)果顯示NSCLC患者組織中IL-35的表達明顯高于肺部良性病變患者，初步表明IL-35在NSCLC患者組織中異常高表達。通過統(tǒng)計分析74例NSCLC患者組織中IL-35表達差異與臨床病理特征之間的相關(guān)性得出：IL-35表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性, 與患者性別、年齡、組織類型、分化程度及遠端轉(zhuǎn)移等均無相關(guān)性，而復(fù)發(fā)和早期轉(zhuǎn)移是NSCLC預(yù)后不良的主要因素，說明IL-35的高表達水平和患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示其可能影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。接著通過體外細胞功能學(xué)實驗證實，人重組IL-35蛋白能明顯促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表明IL-35在NSCLC中可能是一種新的促癌不良因子，參與肺癌的不良進程。因此，IL-35可以作為一個新的有效的治療靶點，應(yīng)用于臨床和靶向藥物的研發(fā)。

綜上所述，IL-35在NSCLC中高表達，并促進肺癌細胞的增殖、遷移與侵襲，為深入研究IL-35對腫瘤的作用提供了線索，IL-35可能是一種NSCLC診斷和預(yù)后判斷的新型標志物，但是IL-35發(fā)揮促癌作用的具體分子機制仍待進一步研究。