腺苷A2a受體激動(dòng)劑(CGS21680)對(duì)幼齡大鼠體外循環(huán)肝臟損傷的保護(hù)作用

儲(chǔ)培逸，葛建軍，左 逸，孔 祥，趙智偉，周正春

現(xiàn)如今心臟手術(shù)的成功離不開(kāi)體外循環(huán)技術(shù)(cardiopulmonary bypass,CPB)，該技術(shù)對(duì)改善患者預(yù)后有著十分重要的作用[1]。雖然現(xiàn)在越來(lái)越多的患者接受心臟手術(shù)，但是CPB這種技術(shù)由于其對(duì)患者全身是一種非常大的刺激，容易給患者帶來(lái)多處組織損傷。之前的研究大多更關(guān)注心臟、肺及腎臟等器官，而對(duì)肝臟的關(guān)注不夠，大約10%的心臟手術(shù)患者，往往存在著術(shù)后肝臟損傷。因此，尋找到一種可以減輕CPB對(duì)于肝臟所帶來(lái)的損害是十分有必要的。

肝臟損傷的機(jī)制包含全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)與氧化應(yīng)激反應(yīng)。SIRS是由一系列復(fù)雜的炎癥反應(yīng)所引起的，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板的激活，以及細(xì)胞因子和白三烯的增加[2]。研究[3]表明，嘌呤核苷腺苷可以調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)。其中G蛋白偶聯(lián)受體，包括A1、A2a、A2b和A3，可以顯著地發(fā)揮腺苷的細(xì)胞活性[4-5]。正是由于A2a受體的存在，抗炎作用十分突出[6]。之前有研究[7]表明，腺苷A2a受體激動(dòng)劑的激活可以減輕CPB后的肺損傷，但對(duì)減輕肝損傷的報(bào)道卻極少。該研究通過(guò)構(gòu)建幼齡大鼠的CPB模型，探討腺苷A2a受體激動(dòng)劑(CGS21680)是否可以減輕幼齡大鼠體外循環(huán)帶來(lái)的肝損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料健康清潔級(jí)幼齡SD大鼠36只，5～6周齡，體質(zhì)量(213±10.5)g，在相對(duì)清潔及恒溫的環(huán)境下，予以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680購(gòu)自英國(guó)Tocris公司。

1.2 方法

1.2.1分組 將36只健康幼齡大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、CPB組及CGS21680組，每組12只，幼齡大鼠術(shù)前12 h禁食及6 h禁水后，假手術(shù)組不進(jìn)行CPB。CGS21680組在轉(zhuǎn)流前往貯血器中加入CGS21680(120 μg/kg)。

1.2.2幼齡大鼠CPB模型的建立 本研究采用了Dong et al[8]開(kāi)發(fā)的成年大鼠CPB模型，經(jīng)腹腔內(nèi)麻醉后氣管切開(kāi)插管接呼吸機(jī)。左側(cè)股動(dòng)脈穿刺24 G靜脈留置針用于監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)及血?dú)狻＝?jīng)右側(cè)頸靜脈置入20 G多孔套管至右心房以引流靜脈血入貯血器，再通過(guò)微量蠕動(dòng)泵以及膜式肺氧合器，從右側(cè)股動(dòng)脈灌注。通過(guò)右側(cè)頸靜脈予以幼齡大鼠全身肝素化。CPB預(yù)充液采用的是含血預(yù)充，共20 ml。轉(zhuǎn)流開(kāi)始后約10 min流量逐漸加大到每分鐘100 ml/kg，并維持此轉(zhuǎn)速1 h后停機(jī)，嚴(yán)密觀察幼齡大鼠的生命體征變化。

1.3 標(biāo)本收集分別于肝素化后轉(zhuǎn)流前(T0)、CPB 30 min(T1)、轉(zhuǎn)流結(jié)束時(shí)(T2)和術(shù)后1 h(T3)從左股動(dòng)脈采集血樣，高速離心機(jī)5 000 r/min離心10 min后，取血漿保存于-80 ℃冰箱留待檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。術(shù)后1 h后處死幼齡大鼠，打開(kāi)胸腔，分離肝臟并分成兩部分，一部分于-80 ℃冰箱保存進(jìn)行相關(guān)炎癥因子等指標(biāo)檢測(cè)，剩余的肝臟切片后，用4%甲醛固定，光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1炎癥因子的檢測(cè) ELISA法：用根據(jù)制造商的指導(dǎo)為幼齡大鼠制備的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定血液中白細(xì)胞介素-1β(interleukinin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukinin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等濃度，其中IL-1β濃度以ng/L表示，IL-6和TNF-α濃度則以μg/L表示。

1.4.2肝功能指標(biāo)的檢測(cè) 通過(guò)自動(dòng)分析器(日本日立公司)檢測(cè)幼齡大鼠的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspertate transaminase，AST)水平，濃度均以U/L表示。

1.4.3抗氧化指標(biāo)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)檢測(cè) 根據(jù)試劑盒(南京建成生物制品)說(shuō)明書指示測(cè)定GSH-PX活性，活性以酶活力單位U表示。

1.5 肝臟組織HE染色肝臟組織標(biāo)本石蠟包埋后，用HE染色組織切片并在光學(xué)顯微鏡下觀察，并由有經(jīng)驗(yàn)且對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情的病理學(xué)專家進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 各組幼齡大鼠術(shù)后一般情況36只幼齡大鼠均順利建立CPB模型，術(shù)后1 h全部存活，酸堿度(potential of hydrogen，pH)、 MAP、紅細(xì)胞比容(hematocrit value，HCT)、PO2、PCO2、iCa等數(shù)據(jù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都很穩(wěn)定，所有數(shù)據(jù)符合臨床且可被接受。見(jiàn)表1。

2.2 各組幼齡大鼠血清ALT、AST水平ALT及AST水平的變化在各組手術(shù)開(kāi)始未發(fā)現(xiàn)差異，術(shù)中的時(shí)候，CPB組ALT及AST水平先降低后上升，而假手術(shù)組依舊保持低水平。而隨著CGS21680組中的藥物加入，雖然并不能改變ALT及AST的變化趨勢(shì)，但是相比較于CPB組，AST及ALT的水平有明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 各組幼齡大鼠血清中炎癥因子指標(biāo)各時(shí)間點(diǎn)的變化各組幼齡大鼠血清中IL-1β及TNF-α的水平在T0時(shí)無(wú)明顯差異，而隨著手術(shù)的開(kāi)始，T1～T3各時(shí)間點(diǎn)，CPB組中血清的炎癥指標(biāo)水平相比較于假手術(shù)組是顯著上升的(P<0.05)，而CGS21680組中相對(duì)于CPB組的炎癥指標(biāo)卻有顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2、3。

2.4 各組幼齡大鼠肝臟炎癥因子指標(biāo)的變化水平CPB組幼齡大鼠肝臟組織的炎癥指標(biāo)顯著上升，IL-1β、IL-6和TNF-α顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，而CGS21680組的各項(xiàng)炎癥指標(biāo)顯著低于CPB組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 各組幼齡大鼠血清中抗氧化指標(biāo)的變化水平

表1 實(shí)驗(yàn)前后幼齡大鼠的基本情況

表2 各組幼齡大鼠血清中IL-1β表達(dá)水平

與CPB組比較：*P<0.05；與CGS21680組比較：#P<0.05; 與假手術(shù)組比較：▽P<0.05

表3 各組幼齡大鼠血清中TNF-α表達(dá)水平

與CPB組比較：*P<0.05；與CGS21680組比較：#P<0.05; 與假手術(shù)組比較：▽P<0.05

表4 各組幼齡大鼠肝臟中的炎癥因子表達(dá)水平

與CGS21680組比較：*P<0.05；與假手術(shù)組比較：#P<0.05

圖1 各組幼齡大鼠肝酶表達(dá)水平

如表5所示，各組幼齡大鼠血清中GSH-PX水平在T0時(shí)無(wú)明顯差異，而T1～T3各時(shí)間點(diǎn)，CPB組與假手術(shù)組則有著顯著差異(P<0.05)。在CGS21680組中，幼齡大鼠的GSH-PX水平顯著高于CPB組(P<0.05)。

表5 各組幼齡大鼠血清中GSH-PX表達(dá)水平

與CPB組比較：*P<0.05；與假手術(shù)組比較：#P<0.05

2.6 各組幼齡大鼠肝組織HE染色情況假手術(shù)組肝索排列整齊，未見(jiàn)腫脹，而CPB組出現(xiàn)肝細(xì)胞溶解和壞死，組織紊亂，部分肝細(xì)胞水腫和少量膽紅素積聚。CGS21680組肝細(xì)胞裂解和壞死要輕于CPB組，但仍存在少量的肝細(xì)胞水腫和組織間隙。見(jiàn)圖2。

3 討論

心臟外科的CPB手術(shù)對(duì)于人及動(dòng)物來(lái)說(shuō)，術(shù)后均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的創(chuàng)傷，目前研究普遍認(rèn)為主要是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，極易產(chǎn)生炎癥等反應(yīng)，這些反應(yīng)大多數(shù)來(lái)說(shuō)都是由于手術(shù)本身創(chuàng)傷、轉(zhuǎn)流過(guò)程中血液與管道接觸、血液細(xì)胞的破壞以及全身多處臟器缺血再灌注損傷，而產(chǎn)生炎癥因子進(jìn)入循環(huán)中導(dǎo)致的。在過(guò)去的三十年中，很多研究關(guān)注CPB后患者的心臟、肺臟及腎臟等器官損傷及保護(hù)[9]。但現(xiàn)在越來(lái)越多的肝臟損傷對(duì)患者治愈率及死亡率的影響逐漸顯現(xiàn)[10]，所以臨床醫(yī)師越來(lái)越多的關(guān)注術(shù)后肝臟損傷，尋找合適的藥物來(lái)減輕CPB帶來(lái)的巨大創(chuàng)傷一直是研究的方向。但出于倫理方面的考慮和其他影響因素，所以未能提供組織供以研究。因此，穩(wěn)定的幼齡大鼠CPB模型是必需的。

圖2 3組肝組織病理圖 HE×200

本研究通過(guò)建立幼齡大鼠的CPB的模型，來(lái)觀察和對(duì)比CPB組與假手術(shù)組的組織病理學(xué)及生化指標(biāo)的變化，可以看出CPB后幼齡大鼠出現(xiàn)了肝臟損傷。而肝臟損傷會(huì)直接導(dǎo)致血清中的轉(zhuǎn)氨酶上升，轉(zhuǎn)氨酶的上升主要是指AST和ALT的上升，這可能是由于CPB的轉(zhuǎn)流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使肝臟出現(xiàn)淤血，從而使細(xì)胞膜及線粒體受損而造成的變化。

通過(guò)檢測(cè)炎癥指標(biāo)的變化可以看出CPB后，幼齡大鼠出現(xiàn)了肝臟損傷，且CPB組的幼齡大鼠的炎癥指標(biāo)水平明顯高于假手術(shù)組，所以IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥指標(biāo)的確起到了損傷肝臟的作用，這些作用可能是以補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)的激活、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血小板的活化及細(xì)胞因子產(chǎn)生等刺激方式觸發(fā)的[11]。

據(jù)報(bào)道，腺苷具有顯著的抗炎能力[12]。由于腺苷A2a受體亞型是炎癥細(xì)胞中表達(dá)的主要腺苷受體，意味著腺苷的大部分抗炎作用可能依賴于A2a受體。而A2a受體也被認(rèn)為存在于所有炎癥細(xì)胞中，包括內(nèi)皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[13]。所以CGS21680可以顯著減少CPB后幼齡大鼠體內(nèi)的炎癥指標(biāo)水平，為了進(jìn)一步探討腺苷受體激動(dòng)劑對(duì)幼齡大鼠肝臟保護(hù)的作用，CGS21680組中幼齡大鼠在接受CGS21680藥物的干預(yù)后炎癥因子的水平有著十分顯著的下降，表明經(jīng)過(guò)CPB后幼齡大鼠體內(nèi)的大量炎癥反應(yīng)的減少可能的確是由于腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680的存在，這些結(jié)果證明藥物CGS21680可以通過(guò)抗炎作用來(lái)減輕幼齡大鼠CPB后所引起的肝臟損傷。

GSH-PX可以通過(guò)催化GSH成為氧化型谷胱甘肽(GSSG)參與抗氧化損傷的細(xì)胞防御。一些研究[14]表明，各種刺激引起的組織損傷與GSH消耗有關(guān)。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)CPB組中GSH-PX顯著低于假手術(shù)組，而CGS21680組中GSH-PX相對(duì)于CPB組來(lái)說(shuō)減少卻并不明顯。所以說(shuō)GSH-PX參與了抗氧化防御。因此，結(jié)果表明腺苷受體的激活可以抑制氧化應(yīng)激從而保護(hù)幼齡大鼠CPB所導(dǎo)致的肝臟損傷。

綜上所述，腺苷受體激動(dòng)劑CGS21680的確能夠顯著地減輕幼齡大鼠CPB所引起的肝臟損傷，這種結(jié)果可能主要是其抗炎與抗氧化應(yīng)激作用所帶來(lái)的[15]。因此，CGS21680藥物可以被認(rèn)為是保護(hù)肝臟損傷的潛在治療藥物，但該藥物對(duì)于肝臟保護(hù)的具體機(jī)制及到臨床使用等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。