CP-25通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞亞群治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎

湯小雨，王 琛，韓 樂(lè)，張賢政，疏金玲，蔡小雨，朱 悅，張玲玲，魏 偉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其主要病理表現(xiàn)在于關(guān)節(jié)滑膜炎。RA在全球都有分布，骨和軟骨破壞是導(dǎo)致患者工作能力喪失和殘疾的主要原因之一[1]。RA的主要病理特征包括滑膜細(xì)胞增生、內(nèi)襯層的增厚、多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨和骨組織的破壞，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。雖然有關(guān)細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)在RA發(fā)病中的作用做了大量研究，但RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。異?；罨腡細(xì)胞在RA病理機(jī)制中起關(guān)鍵作用，同時(shí)分化的T細(xì)胞亞群在RA中也存在失衡。其中，Th17細(xì)胞分泌高水平的IL-17，加速RA的發(fā)生發(fā)展[3]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)是一種免疫炎性動(dòng)物模型，因?yàn)樵撃Ｐ陀性S多組織學(xué)和免疫學(xué)特征與RA相似，所以是篩選和研究治療RA的藥物的比較理想的動(dòng)物模型[4]。

芍藥苷-6-氧-苯磺酸(paeoniflorin-6'-O-benzenesulfonate, CP-25)是衍生的新型芍藥苷活性單體。課題組前期研究[5-6]顯示CP-25能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答而抑制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎、小鼠CIA的繼發(fā)炎癥。艾拉莫德是具有免疫調(diào)節(jié)活性的環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)抑制藥，臨床用于治療成人活動(dòng)性RA[7]。艾拉莫德對(duì)大鼠CIA有明顯的抗炎作用及關(guān)節(jié)滑膜保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)致炎因子白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平有關(guān)[8]。該研究擬在通過(guò)建立大鼠CIA模型的基礎(chǔ)上，觀察CP-25對(duì)大鼠CIA的治療作用以及對(duì)活化T細(xì)胞亞群和分化T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性Wistar大鼠購(gòu)于上海斯萊克公司，(150±20)g，42 d齡，合格證號(hào)：2015000532883。大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)。本研究所采用的實(shí)驗(yàn)方案均遵循實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理準(zhǔn)則，且經(jīng)過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2藥物和試劑 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)通道小鼠抗-兔CD3、別藻青蛋白(allocyanin, APC)通道小鼠抗-兔CD4、藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)通道小鼠抗-兔 CD25、PE小鼠抗-兔 IFN-γ、PE 小鼠抗-兔 IL-4購(gòu)自美國(guó)Becton, Dickinson(BD) 抗體公司；抗-小鼠/兔 IL-17A PE、FITC抗-小鼠/兔轉(zhuǎn)錄因子蛋白3(forkhead box protein 3, Foxp3)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；雞II型膠原(CII)購(gòu)自美國(guó)康德瑞公司；PBS：KCl 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 1.82 g和KH2PO40.2 g溶于雙蒸水800 ml，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.4，高壓蒸汽滅菌，儲(chǔ)存在4 ℃下以備使用；艾拉莫德(iguratimod)：江蘇先聲藥業(yè)有限公司國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)H20110084(25 mg，14粒/盒)；CP-25：由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所制藥部門提供，白色粉末，純度大于98%。

1.2 主要儀器AA-200DS電子天平購(gòu)自美國(guó)Denver Instrument公司；Bio Tek Elx×808 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司，BX-50型正置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；FC500流式細(xì)胞儀、FACScan儀器購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；GL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠；JA2003A型電子分析天平購(gòu)自中國(guó)上海精天電子儀器廠；KDC-40超速離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)安徽科大創(chuàng)新中佳公司；Sim-F140制冰機(jī)購(gòu)自日本SANYO公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)購(gòu)自江蘇蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司，YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x購(gòu)自中國(guó)山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院；高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣STURDY公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大 鼠CIA模型的制備 在操作臺(tái)中，將雞Ⅱ型膠原溶于 0.05 mol/L的冰醋酸中，并在4 ℃下攪拌至完全溶解，終濃度為 4 mg/ml，置 4 ℃ 冰箱過(guò)夜，再將卡介苗(濃度為8 mg/ml)與其等體積混合使之充分乳化以制備雞II型膠原乳液(所有操作都需要避光并且無(wú)菌)。第0天(第1次免疫日)于每只大鼠尾根部、足趾部多點(diǎn)(3～4點(diǎn))皮內(nèi)注射 0.2 ml CⅡ乳劑。第7天在尾根部、背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 ml的該乳劑作為加強(qiáng)[9]。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組和給藥情況 Wistar系雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、CP-25組和艾拉莫德組，每組10只。除正常組外，另外三組大鼠均制備CIA模型。大鼠建立CIA模型，第2次激發(fā)誘導(dǎo)后，當(dāng)大鼠足爪出現(xiàn)紅腫即開(kāi)始給藥。CP-25組大鼠每天1次灌胃給予CP-25，劑量為每只大鼠50 mg/kg，艾拉莫德組大鼠每天1次灌胃給予艾拉莫德，劑量為每只大鼠10 mg/kg，兩種藥均持續(xù)給藥7周。正常組和模型組大鼠用相同體積生理鹽水灌胃。

1.3.3足趾容積測(cè)量和關(guān)節(jié)炎足爪腫脹數(shù)評(píng)分 大鼠建立CIA模型后，每隔3 d對(duì)CIA大鼠進(jìn)行1次足趾容積測(cè)量。炎癥出現(xiàn)后，每隔3 d對(duì)CIA大鼠進(jìn)行1次關(guān)節(jié)炎足爪腫脹數(shù)評(píng)分。按 0～4五級(jí)評(píng)分：每只足爪計(jì)1個(gè)踝關(guān)節(jié)和5個(gè)趾關(guān)節(jié)，每個(gè)關(guān)節(jié)腫脹為1分，每只鼠累計(jì)最多關(guān)節(jié)腫脹數(shù)24分。

1.3.4CIA大鼠脾臟的病理學(xué)觀察 處死大鼠后，將脾臟無(wú)菌剝離并用HE染色。顯微鏡下觀察不同組大鼠的組織病理學(xué)變化。根據(jù)動(dòng)脈周圍淋巴鞘的細(xì)胞密度，淋巴結(jié)節(jié)(淋巴濾泡)增生，紅髓充血和生發(fā)中心的數(shù)量確定脾臟病理學(xué)，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[10]。

1.3.5CIA大鼠踝關(guān)節(jié)的病理學(xué)觀察 先用10%甲醛溶液將大鼠踝關(guān)節(jié)固定后脫鈣脫水，用石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察不同組大鼠踝關(guān)節(jié)的組織病理形態(tài)，根據(jù)滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨侵蝕的狀況來(lái)確定脾臟病理學(xué)，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示[11]。

1.3.6胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的測(cè)定 第56天處死大鼠，在無(wú)菌環(huán)境中取脾臟和胸腺并分別稱重。分別用每只大鼠“胸腺或脾臟的質(zhì)量”比上相應(yīng)“大鼠的質(zhì)量”，即得到胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)。

1.3.7T、B淋巴細(xì)胞的分離 處死大鼠后，無(wú)菌剝離胸腺和脾臟。先常規(guī)制備胸腺細(xì)胞懸液和脾臟細(xì)胞懸液，再經(jīng)大鼠淋巴細(xì)胞分離液純化，從胸腺中分離出T淋巴細(xì)胞，從脾臟中分離出B淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml。

1.3.8ConA誘導(dǎo)的胸腺T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 將1.3.7得到的胸腺T細(xì)胞以每孔約1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640，最終體積為200 μl，每個(gè)具有3個(gè)重復(fù)孔。加入ConA后置5%CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育48 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1～4 h，然后取出96孔板，將其置于酶-連接免疫吸附檢測(cè)器，搖動(dòng)15 s，然后在450 nm測(cè)量吸光度并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 CIA大鼠脾臟病理的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(n=10)

表2 CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.9LPS誘導(dǎo)的脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 將1.3.7得到的脾臟B細(xì)胞以每孔約1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640，最終體積為200 μl，每個(gè)具有3個(gè)重復(fù)孔。加入LPS后置在5%CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育48 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1～4 h，然后取出96孔板，將其置于酶-連接免疫吸附檢測(cè)器，搖動(dòng)15 s，然后在450 nm測(cè)量吸光度并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血T細(xì)胞比例及脾臟T細(xì)胞亞群的表達(dá) 通過(guò)尾部血液取樣獲得大鼠外周血，并用紅細(xì)胞裂解物分離淋巴細(xì)胞。根據(jù)說(shuō)明書(shū)中推薦的濃度比，將CD3(FITC通道)、CD4(APC通道)和CD25(PE通道)的抗體組合分別添加到圓底管中。在室溫下避光孵育后，洗滌細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。用FACScan儀器和相關(guān)的CellQuest軟件分析細(xì)胞相關(guān)的熒光。第56天處死大鼠取脾臟，用紅細(xì)胞裂解液分離脾臟淋巴細(xì)胞，然后將淋巴細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到圓底管中。將CD4(APC通道)、IL-17A(PE通道)、IFN-γ(PE通道)、IL-4(PE通道)的抗體組合按照說(shuō)明書(shū)建議的濃度比例分別添加到圓底管中。① 細(xì)胞需要提前加4 μl細(xì)胞刺激劑，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育6～8 h；② 6～8 h后取出細(xì)胞轉(zhuǎn)移至微量離心管(EP管)中離心(2 500 r/min，10 min)后，棄上清液，用PBS洗滌1次，再離心；③ 在避光室溫下添加表面抗體CD4(APC通道)孵育20 min；④ 每孔添加80 μl固定劑，振蕩，在室溫下避光孵育10 min，搖晃；⑤ 洗滌通過(guò)離心，每孔添加80 μl打孔劑，在室溫下避光孵育8 min；加胞內(nèi)抗體IL-17A(PE通道)避光孵育20 min(不可振蕩)。在室溫黑暗中孵育后，洗滌細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞的檢測(cè)同上。

2 結(jié)果

2.1 CIA大鼠的腫脹情況及藥物的影響第1次造模作為第0天，7 d后加強(qiáng)給藥，第12天大鼠足爪出現(xiàn)紅腫，首先是原發(fā)側(cè)紅腫，以后延伸到繼發(fā)側(cè)、尾部、耳部。從第12天給予CP-25、艾拉莫德治療。同時(shí)開(kāi)始每周進(jìn)行兩次足趾容積測(cè)量、足爪腫脹數(shù)計(jì)數(shù)。肉眼觀察顯示，第21～31天為腫脹高峰期，第38天后腫脹逐漸減輕。CP-25、艾拉莫德明顯降低CIA大鼠足爪腫脹(圖1A)。與正常組比較，CIA模型組足趾容積、足爪腫脹數(shù)評(píng)分明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，CP-25、艾拉莫德能夠減輕大鼠CIA的足趾容積、足爪腫脹數(shù)(P<0.05)。模型組、CP-25組、艾拉莫德組足趾容積、足爪腫脹數(shù)評(píng)分在第21～31天達(dá)到高峰值隨后逐漸下降(P<0.05)。其中CP-25組大鼠CIA的足爪腫脹數(shù)從第32天逐漸下降。艾拉莫德組大鼠足爪腫脹數(shù)從第30天逐漸下降(圖 1B、1C)。

2.2 CIA大鼠脾臟病理變化情況及CP-25的影響將脾臟病理從以下四個(gè)方面進(jìn)行分析：生發(fā)中心，淋巴鞘，淋巴濾泡，紅髓。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，光鏡下CIA模型組大鼠脾臟白髓淋巴組織明顯增生，淋巴鞘細(xì)胞密度增加，生發(fā)中心出現(xiàn)(P<0.05)；與模型組比較，CP-25組白髓淋巴組織增生明顯減輕，生發(fā)中心和淋巴濾泡增生明顯減輕，淋巴鞘細(xì)胞密度增加也顯著減弱(P<0.05)(圖2)。

2.3 CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)的檢查通過(guò)以下四個(gè)方面對(duì)足關(guān)節(jié)病理進(jìn)行分析：滑膜細(xì)胞增生，細(xì)胞侵蝕，血管翳，炎癥，骨侵蝕。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，光鏡下可見(jiàn)CIA模型組大鼠的滑膜組織中滑膜細(xì)胞增生明顯，層次增多，排列紊亂，滑膜下層纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管翳形成，軟骨中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨組織破壞(P<0.05)；與模型組比較，CP-25組和艾拉莫德組不同程度改善以上病理變化，滑膜細(xì)胞層未見(jiàn)明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；明顯改善滑膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜血管充血(P<0.05)(圖3)。

2.4 CP-25降低CIA大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)4組大鼠胸腺指數(shù)的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表5。與正常組比較，CIA模型組大鼠的胸腺指數(shù)明顯升高(P<0.05)。與CIA模型組比較，CP-25組、艾拉莫德組明顯降低胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(P<0.05)(圖 4A)。統(tǒng)計(jì)四組大鼠胸腺增殖指數(shù)和脾臟增殖指數(shù)的結(jié)果，見(jiàn)表6。與正常組比較，CIA模型組大鼠的T、B淋巴細(xì)胞增殖能力明顯增加(P<0.05)。與CIA模型組比較，CP-25組、艾拉莫德組CIA大鼠的T、B淋巴細(xì)胞的增殖明顯被抑制(P<0.05)(圖 4B)。

圖1 CP-25對(duì)CIA大鼠足爪腫脹的影響及對(duì)足趾容積、足爪腫脹數(shù)的影響

A：CP-25對(duì)CIA大鼠足爪腫脹的影響；a：正常組；b：模型組；c：CP-25組；d：艾拉莫德組；B：CP-25對(duì)CIA大鼠足趾容積的影響；C：CP-25對(duì)大鼠足爪腫脹數(shù)的影響；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；CP-25組與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；艾拉莫德組與模型組比較：▽P<0.05，▽▽P<0.01

圖2 CP-25對(duì)大鼠脾臟病理變化的影響

A：各組大鼠脾臟的病理圖×10；a：正常組：↑顯示紅髓，↓顯示白髓；b：模型組：→出現(xiàn)生發(fā)中心，←顯示淋巴濾泡增生；c：CP-25組；d：艾拉莫德組；B：CP-25對(duì)CIA大鼠脾臟病理的影響的統(tǒng)計(jì)分析；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 CP-25對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響

A：各組大鼠踝關(guān)節(jié)的病理圖×10；a：正常組：↓呈單層滑膜；b：模型組：↓顯示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，←顯示血管翳，→顯示軟骨破壞；c：CP-25組；d：艾拉莫德組；B：CP-25對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的影響的統(tǒng)計(jì)分析；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 CP-25對(duì)CIA大鼠脾臟病理的影響

表4 CP-25對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的影響

表5 CP-25對(duì)CIA大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

表6 CP-25對(duì)CIA大鼠胸腺、脾臟增殖指數(shù)的影響

表7 CP-25對(duì)CIA大鼠外周血各細(xì)胞亞群變化的影響

圖4 CP-25對(duì)大鼠胸腺、脾臟指數(shù)及T、B細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

A： CP-25對(duì)大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響；B：CP-25對(duì)大鼠胸腺T細(xì)胞、脾臟B細(xì)胞增殖指數(shù)的影響；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組相比：#P<0.05，##P<0.01

圖5 CP-25對(duì)CIA大鼠外周血各T細(xì)胞所占比例的影響及統(tǒng)計(jì)分析

A：CP-25對(duì)CIA大鼠外周血各細(xì)胞所占比例的影響的流式圖；B：CP-25對(duì)CIA大鼠外周血各細(xì)胞所占比例的統(tǒng)計(jì)分析；與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01

2.5 CIA大鼠外周血活化T細(xì)胞亞群變化及CP-25對(duì)其影響將細(xì)胞流式術(shù)分析測(cè)得的CIA大鼠外周血中各細(xì)胞百分比的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表7。與正常組比較， CIA模型組中大鼠外周血CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞所占比例顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CP-25組中CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞的比例明顯降低(P<0.05)(圖 5)。

2.6 CIA大鼠脾臟分化T細(xì)胞亞群變化及CP-25對(duì)其影響通過(guò)統(tǒng)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠脾臟分化T細(xì)胞亞群脾臟CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞，CD4+IL-4+Th2細(xì)胞，CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的百分比，見(jiàn)表8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，CIA模型組中大鼠脾臟中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2的比例顯著升高，CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的比例顯著升高，P<0.05；與模型組比較，CP-25顯著降低大鼠脾臟中CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞，CD4+IL-4+Th2細(xì)胞的表達(dá)比例，明顯減少大鼠脾臟中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的百分含量(P<0.05)(圖6)。

表8 CP-25對(duì)CIA大鼠脾臟各細(xì)胞亞群變化的影響

圖6 CP-25對(duì)CIA大鼠脾臟Th1、Th2、Th7細(xì)胞亞群變化的影響及統(tǒng)計(jì)分析

A:CP-25對(duì)CIA大鼠脾臟中各細(xì)胞在脾臟中百分含量的影響的流式圖；B：CP-25對(duì)CIA大鼠脾臟中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2、CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞在脾臟中百分含量的影響的統(tǒng)計(jì)分析；與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

芍藥是一種中藥，具有抗炎、解痙和止痛作用。白芍(total glucosides of paeony, TGP)是從芍藥的根部中提取，并批準(zhǔn)了1998年芍藥苷(Paeoniflorin, Pae)治療RA。Pae是TGP的有效天然活性成分。TGP和Pae具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[12]。為了提高Pae的生物利用度，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)Pae的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾獲得了CP-25[3]。

CIA模型的臨床表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，病理變化主要是增殖性滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨的破壞、骨侵蝕、在關(guān)節(jié)腔內(nèi)有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等；有高濃度 IgG抗體自體II型膠原存在于動(dòng)物體內(nèi)[13]。由于其病理過(guò)程及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與RA相似，是篩選和研究治療RA藥物的較理想模型[14]。本研究中，肉眼觀察到CP-25能夠減輕CIA大鼠的腫脹情況，降低CIA大鼠的足趾容積、減少CIA大鼠的足爪腫脹數(shù)。光鏡下觀察到CP-25可以明顯改善CIA大鼠脾臟病理情況，減輕白髓淋巴組織增生，減少生發(fā)中心個(gè)數(shù)和緩解濾泡增生，淋巴鞘細(xì)胞密度的增加也被顯著減弱；CP-25可以不同程度改善CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理情況，CP-25組大鼠滑膜細(xì)胞層正常，細(xì)胞浸潤(rùn)減少，滑膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜血管充血被明顯改善。該研究結(jié)果提示CP-25對(duì)大鼠CIA繼發(fā)炎癥具有明顯抗炎作用。

RA是一種自身免疫性疾病，T和B淋巴細(xì)胞的參與該病的發(fā)生和發(fā)展。效應(yīng)T細(xì)胞可以分為Th1細(xì)胞(CD4+IFN-γ+)、Th2細(xì)胞(CD4+IL-4+)和Th17細(xì)胞(CD4+，IL-17A+)。其中，Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生IFN-γ和IL-2，并在細(xì)胞免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起促進(jìn)作用；Th2細(xì)胞主要生產(chǎn)IL-4、IL-5和IL-13，它可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，并促進(jìn)抗體產(chǎn)生和體液免疫；Th17細(xì)胞分泌的IL-17能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞活化及基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨降解[15]。因此T、B淋巴細(xì)胞間相互作用在RA的發(fā)病機(jī)制中有著非常重要的意義。本研究結(jié)果顯示CP-25可以抑制CIA大鼠體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，提示CP-25對(duì)CIA大鼠的治療作用與T、B淋巴細(xì)胞有一定關(guān)系。CP-25可以降低CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞的表達(dá)；CP-25可以降低CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞、CD4+IL-4+Th2細(xì)胞的表達(dá)。因此，CP-25可能通過(guò)影響效應(yīng)T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)之間的平衡來(lái)調(diào)控大鼠CIA的異常免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，CP-25對(duì)大鼠CIA有明顯治療作用，可以有效緩解CIA大鼠的足趾容積增加、腫脹數(shù)增加，改善脾臟、踝關(guān)節(jié)病理變化，在CIA的發(fā)病過(guò)程中，CP-25具有良好的抗炎免疫軟調(diào)節(jié)活性，可能通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)CIA大鼠體內(nèi)異常的免疫反應(yīng)，這一研究提示CP-25在臨床治療RA有潛在前景。