保鮮盒包裝冷鮮牛肉貯藏期間品質(zhì)及菌相變化

付麗，高雪琴，胡曉波，*，郝修振，馬路石

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品工程系，河南 鄭州 450046；2.河南伊賽牛肉股份有限公司，河南 焦作 454450）

牛肉營養(yǎng)豐富、高蛋白質(zhì)、低脂肪，早已是中國人主要消費的肉類，且在肉類消費中的比重增加最快[1]，預測我國2025 年牛肉需求量可達到1 200 萬噸[2]。冷鮮牛肉更是具有鮮嫩、美味、安全、衛(wèi)生等優(yōu)點而深受消費者喜愛[3]，在發(fā)達國家達100%的市場占有率[4]。但由于0 ℃～4 ℃貯存并不能完全抑制微生物的生長，貯藏、運輸、銷售過程中易受污染而發(fā)生腐敗變質(zhì)，造成冷鮮牛肉貨架期短。近年來，國內(nèi)外有關(guān)屠宰后牛胴體減菌技術(shù)、冷鮮牛肉保鮮技術(shù)的研究報道較多，但對于牛肉初始菌相以及冷藏過程中品質(zhì)及菌相變化的研究較少，由于缺少理論基礎(chǔ)研究，使得保鮮技術(shù)、減菌技術(shù)的針對性不強，效果不佳，因此進行冷鮮牛肉貯藏過程中品質(zhì)變化及菌相變化的研究具有重要意義。

本試驗以冷鮮牛肉為研究對象，測定其在0 ℃～4 ℃條件下貯藏第0、1、3、5、7 天時的感官指標、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N 值）、pH 值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS 值）、菌落總數(shù)和大腸菌群等指標的變化并進行指標間相關(guān)性分析，研究冷鮮牛肉貯藏期間感官品質(zhì)、新鮮度的變化；采用選擇性培養(yǎng)基對0 ℃～4 ℃下貯藏第 0、1、3、5、7 天的冷鮮牛肉中乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌以及熱死環(huán)絲菌的生長情況進行測定，初步分析冷鮮牛肉貯藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌，為冷鮮牛肉保鮮新技術(shù)的開發(fā)提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉（牛后腿肉）：由河南伊賽牛肉股份有限公司提供。宰前檢驗合格的活牛屠殺后，進行排酸后剔骨分割，并由冷藏車在0 ℃～4 ℃條件下2 h 內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇摇?/p>

氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅、三氯乙酸、KCl、甘油等（均為分析純）：河南華豐試劑股份有限公司。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、CFC 選擇性培養(yǎng)基、STAA選擇性培養(yǎng)基、VRBGA 選擇性培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基（均為生物試劑）：河南華豐股份有限公司。

塑料保鮮盒（方形，650 mL）：蘇州康百樂餐飲用品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-080 電熱恒溫培養(yǎng)箱：鄭州生元儀器有限公司；SHA-B 水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾股份有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療儀器公司；K9840 半自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；BlueStarB 紫外可見分光光度計：北京萊泊泰科股份有限公司；PHSJ-3F 酸度計：上海儀器海電股份偶限公司；2.5L 厭氧培養(yǎng)罐：日本三菱瓦斯化學株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉樣的處理

先開啟無菌室紫外燈照射30 min 后，再將肉樣拿入無菌室。在無菌條件下打開包裝取出牛肉，剔除表面結(jié)蹄組織、多余脂肪、筋膜等，用無菌刀和案板將牛肉切成 5 cm×5 cm×5 cm 大小肉樣，共 30 塊，將處理好的肉樣在無菌的條件下充分混合以保證肉樣初始菌數(shù)一致。將肉樣分為5 組，每組6 塊，分別裝入事先編號的無菌保鮮盒內(nèi)，加蓋，放于0 ℃～4 ℃的冷鮮庫貨架上，備用。

1.3.2 保鮮盒包裝冷鮮牛肉貯藏期間感官品質(zhì)及新鮮度的變化

分別在貯藏第 0、1、3、5、7 天時從冷庫內(nèi)取出肉樣，每次3 盒。檢測肉樣的感官指標、揮發(fā)性鹽基氮值（TVB-N）、pH 值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物值（TBARS）、菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)的變化及指標間相關(guān)性分析，研究肉樣貯藏期間感官品質(zhì)及新鮮度的變化。

1.3.3 保鮮盒包裝冷鮮牛肉中菌相的初步分析

分別在貯藏 0、1、3、5、7 天時從冷庫內(nèi)取出肉樣，每次3 盒。在無菌條件準確稱取絞碎的肉樣25 g，放入盛有225 mL 無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，然后放入均質(zhì)機中拍打均質(zhì)30 s 獲得10-1稀釋菌液，逐級稀釋。選擇2～3 個合適稀釋度的菌液，采用涂布法接種于CFC、STAA、MRS 瓊脂及 VRBDA 瓊脂 4 種選擇性培養(yǎng)基中，每個稀釋度做個重復，待凝固后編號，倒置恒溫培養(yǎng)，進行菌數(shù)計數(shù)，研究保鮮盒包裝冷鮮牛肉中優(yōu)勢腐敗菌的生長變化，觀察菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色、動力學試驗等進一步菌種鑒定。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌手冊》對典型菌落進行氧化酶、過氧化氫酶及精氨酸雙水解酶試驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 感官指標

參照GB/T 22210-2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》[5]中感官指標評定方法及孫凱旋等[6]感官評價方法并稍做改動。由10 名食品專業(yè)人員組成評定小組，評定指標包括色澤、氣味、黏度、彈性四項，每項滿分均為25 分，采用百分制，四項指標評分加合為肉樣的總評分。感官指標評分標準見表1。

表1 感官指標評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4.2 TVB-N 測定

測定方法按GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[7]中的半微量凱氏定氮法進行。將肉樣絞碎混勻后，取10 g 放于干凈的消化管內(nèi)，加入75 mL 蒸餾水，靜置30 min，加入1 g 氧化鎂。用全自動凱氏定氮儀進行TVB-N 值測定。其值≤15 mg/100 g 為一級新鮮牛肉，≤20 mg/100 g 為二級，≥20 mg/100 g 時則為變質(zhì)肉[8-9]。

1.4.3 pH 值測定

取絞碎的肉樣40 g，放于盛有100 mL 0.1 mol/L KCl 溶液的燒杯中，參照GB/T 5009.237-2016《食品安全國家標準食品pH 值得測定》[10]進行測定。正常冷鮮牛肉 pH 值為 5.8～6.2，次級鮮肉 pH 值為 6.3～6.6，變質(zhì)肉 pH＞6.7[11]。

1.4.4 TBARS 值測定

測定方法按GB 5009.181-2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》[12]中分光光度法進行。當TBARS 值大于0.5 mg/kg 時，就會產(chǎn)生因脂肪氧化而產(chǎn)生的酸敗味[13]。

1.4.5 菌落總數(shù)的測定

測定方法按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[14]規(guī)定的方法進行。肉樣新鮮度評價參照歐麗娟等[15]和Duun 等[16]的標準：菌落總數(shù)＜4.0log（CFU/g）為新鮮肉，在 4.0log（CFU/g）～6.0log（CFU/g）之間為次鮮肉，＞6.0 log（CFU/g）為變質(zhì)肉。

1.4.6 大腸菌群測定

依據(jù)GB4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[17]中第二法大腸菌群平板計數(shù)法進行測定。

1.4.7 假單胞菌、乳酸菌、熱死環(huán)絲菌及腸桿菌的分離與計數(shù)

Russo 等[18]研究得出，熱死環(huán)絲菌、假單胞菌、腸桿菌和乳酸菌是牛肉冷藏過程中生長的優(yōu)勢菌種，因此本試驗采用這4 種菌進行分離與計數(shù)。參照陳銳穎[13]的方法，分別采用相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)并進行平板計數(shù)。培養(yǎng)溫度為（30±1）℃，培養(yǎng)時間為48 h。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗重復3 次，結(jié)果表示為平均數(shù)值±標準差，圖表采用Sigmaplot13.0 繪制，數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析和相關(guān)性分析，顯著性水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷鮮牛肉貯藏期間感官品質(zhì)及新鮮度的變化

2.1.1 冷鮮牛肉貯藏期間感官指標的變化

冷鮮牛肉貯藏期間感官指標變化圖1。

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣的感官評分呈逐漸下降的趨勢。以第0 天肉樣感官評分為100為標準，第1 天肉樣感官評分為98，與第0 天時差異不顯著（P＞0.05）；從第3 天開始，肉樣的感官評分呈極顯著下降（P＜0.01），第 5 天時為 61，屬次鮮肉；第 7 天時肉樣的感官評分為42，說明肉樣已腐敗。

2.1.2 冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N 的變化

冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N 變化見圖2。

圖1 冷鮮牛肉貯藏期間感官評分雷達圖Fig.1 Radar map of sensory score of chilled beef during storage

圖2 冷鮮牛肉貯藏期間TVB-N 值變化Fig.2 Changes in TVB-N of chilled beef during storage

揮發(fā)性鹽基氮是牛肉在腐敗過程中，由于細菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的胺類堿性含氮物質(zhì)。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣的TVB-N 值呈逐漸上升的趨勢（P＜0.05），尤其是第 3 天開始，肉樣的 TVB-N 值呈極顯著增加（P＜0.01）。第 0 天時肉樣的 TVB-N 值為 8.016 mg/100 g；貯藏 1 天后 TVB-N 值增加為8.621 mg/100 g，第 3 天增加為 10.762 mg/100 g；第 5 天肉樣的TVB-N 值達到15.774 mg/100 g，為次鮮肉；肉樣貯藏第7 天時，TVB-N 值超過20 mg/100 g，說明肉樣已腐敗。張婷[19]研究得出自封袋包裝的冷藏牛肉貯藏 2 天后 TVB-N 值接近 15 mg/100 g，5 d 后超標。張鐵華等[20]研究未經(jīng)包裝的冷鮮牛肉貯藏第5 天時TVBN 值已超過20 mg/100 g，這說明保鮮盒包裝在一定程度上可以延長牛肉的貨架期。

2.1.3 冷鮮牛肉貯藏期間pH 值的變化

冷鮮牛肉貯藏期間pH 值變化見圖3。

圖3 冷鮮牛肉貯藏期間pH 變化Fig.3 Changes in pH of chilled beef during storage

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣pH 值呈逐漸增加的趨勢，且從第3 天開始肉樣的pH 值顯著增加（P＜0.01）。在第 1 天時肉樣的 pH 值為 5.83，與第0 天時差異并不顯著（P＞0.05），說明肉樣非常新鮮；第3 天時肉樣的pH 值增長為5.90，與第1 天相比差異極顯著（P＜0.01），原因是肉樣蛋白質(zhì)在腐敗菌產(chǎn)生的蛋白酶作用下分解成胺類等堿性物質(zhì)使pH 值升高，但肉樣仍為鮮肉；第5 天時肉樣的pH 值大于6.00，這與陳銳穎[13]的研究結(jié)果是一致的。第7 天時肉樣的pH 值為6.14，仍小于6.20，原因可能是肉樣采用塑料盒加蓋包裝，造成了一定的厭氧環(huán)境，使好氧菌生長受到一定的抑制，而乳酸菌等兼性厭氧菌生長繁殖產(chǎn)生一定量的乳酸，使肉樣pH 值升高延緩，這是圖7中得到了證實。

2.1.4 冷鮮牛肉貯藏期間TBARS 值的變化

冷鮮牛肉貯藏期間TBARS 變化見圖4。

圖4 冷鮮牛肉貯藏期間TBARS 值變化Fig.4 Changes in TBARS of chilled beef during storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣的TBARS值呈逐漸上升的趨勢。第0 天時肉樣的TBARS 值為0.05 mg/kg，貯藏 1 d 后，該值極顯著升高（P＜0.01），貯藏第7 天時該值達到0.238 mg/kg，仍小于0.5 mg/kg，原因可能是也于肉樣采用塑料盒加蓋包裝有關(guān)。

2.1.5 冷鮮牛肉貯藏期間菌落總數(shù)的變化

冷鮮牛肉貯藏貯藏期間菌落總數(shù)變化見圖5。

圖5 冷鮮牛肉貯藏過程中菌落總數(shù)變化Fig.5 Changes in colony count of chilled beef during storage

由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣菌落總數(shù)呈逐漸上升的趨勢。第0 天時肉樣菌落總數(shù)對數(shù)值為4.61，貯藏 1 d 后為 4.73，兩者差異并不顯著（P＞0.05），原因是0 ℃～4 ℃貯藏能有效的抑制菌落總數(shù)初期的生長。貯藏3 天時肉樣菌落總數(shù)顯著增加（P＜0.05），其對數(shù)值達到5.46，說明第3 天是肉樣菌數(shù)增長的對數(shù)期，即為抑菌的最佳時期。貯藏第3 天至第7 天時肉樣菌落總數(shù)仍呈上升趨勢，但增長速度減慢（P＞0.05），說明細菌生長接近穩(wěn)定期。第5 天時肉樣菌落總數(shù)對數(shù)值已接近6.0，說明肉樣已為次鮮肉。第7 天時肉樣菌落總數(shù)對數(shù)值已超過6.0，說明肉樣已腐敗。這與李升升與靳義超[21]研究得出的托盤包裝的冷鮮牛肉的在第9 天時菌落總數(shù)對數(shù)值仍低于6.0 的結(jié)果不一致，可能是原料肉初始菌數(shù)及包裝形式不同的原因。

2.1.6 冷鮮牛肉貯藏過程中大腸菌群變化

冷鮮牛肉貯藏過程中大腸菌群變化見圖6。

圖6 冷鮮牛肉貯藏期間大腸菌群變化Fig.6 Changes in the number of coliform of chilled beef during storage

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，肉樣大腸菌群數(shù)呈逐漸增加的趨勢。貯藏第1 天和第0 天時肉樣大腸菌群數(shù)差并不顯著（P＞0.05），原因是低溫條件下貯藏能在短期內(nèi)有效控制大腸菌群的增長。貯藏3 d后肉樣大腸菌群數(shù)顯著增加（P＜0.05），尤其是貯藏第7 天時肉樣大腸菌群數(shù)與第5 天時的值差異極顯著（P＜0.01）。

2.1.7 指標間相關(guān)性分析

肉樣感官指標及新鮮度指標相關(guān)性分析結(jié)果見表2。

表2 肉樣指標間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis among five indexes in specimens

由表2可知，pH 值與TVB-N 值呈極顯著正相關(guān)，且均與菌落總數(shù)呈顯著正相關(guān)，這與李升升與靳義超[21]研究發(fā)現(xiàn)的在反映肉新鮮度上，pH 值、TVB-N 與菌落總數(shù)相關(guān)性大的結(jié)果一致，說明三者都能很好的反映肉品的新鮮度。與李飛燕[22]研究得出的保鮮袋包裝冷卻牛肉貯藏期間pH 值與TVB-N 值、菌落總數(shù)呈顯著正相關(guān)的結(jié)論也是一致的。肉樣感官品質(zhì)評分與pH值、TVB-N 值、菌落總數(shù)呈極顯著負相關(guān)，原因是pH值、TVB-N 值、菌落總數(shù)評價肉樣新鮮度的主要指標，其值越高說明肉樣越不新鮮，則感官評分越低，說明肉品的品質(zhì)與肉品的新鮮度密切相關(guān)，通過測定肉品鮮度指標可反映肉品質(zhì)；TBARS 值是反應(yīng)肉樣中脂肪氧化酸敗的指標，其值越高則肉樣越不新鮮，與pH值、TVB-N 值及菌落總數(shù)呈顯著相正相關(guān)，與感官品質(zhì)呈顯著負相關(guān)，說明TBARS 值也能很好的反應(yīng)肉品質(zhì)。

2.2 保鮮盒包裝冷鮮牛肉中菌相的初步分析

2.2.1 冷鮮牛肉中假單胞菌、乳酸菌、熱死環(huán)絲菌及腸桿菌的生長變化

冷鮮牛肉貯藏期間假單胞菌、乳酸菌、熱死環(huán)絲菌及腸桿菌變化見圖7。

圖7 冷鮮牛肉貯藏期間幾種菌菌數(shù)變化Fig.7 Changes in the number of several bacteria of chilled beef during storage

由圖7可知，假單胞菌、乳酸菌在第0 天時菌數(shù)對數(shù)值分別為4.93 和4.95，顯著高于熱死環(huán)絲菌（P＜0.05），說明這兩種菌在牛肉貯藏第0 天時為優(yōu)勢菌；腸桿菌的菌數(shù)對數(shù)值為2.15，菌數(shù)最低（P＜0.01）。貯藏第1 天到第3 天時假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌數(shù)呈上升趨勢，而熱死環(huán)絲菌菌數(shù)無顯著變化（P＞0.05），其中假單胞菌和乳酸菌數(shù)仍然顯著高于熱死環(huán)絲菌（P＜0.05）和腸桿菌（P＜0.01），說明這兩者菌落還是優(yōu)勢菌。第5天時熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和乳酸菌菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于腸桿菌（P＜0.01），以熱死環(huán)絲菌數(shù)最高。第7 天時，假單胞菌菌數(shù)對數(shù)值最高為6.04，顯著高于乳酸菌和熱死環(huán)絲菌（P＜0.05）及腸桿菌（P＜0.01）?？梢娫诒ｕr盒包裝的冷鮮牛肉中主要優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌，其次為乳酸菌和熱死環(huán)絲菌，腸桿菌的菌數(shù)相對比較少。

陳銳穎等[13]研究真空包裝牛肉的優(yōu)勢腐敗菌為乳酸菌和假單胞菌，其次熱死環(huán)絲菌和腸桿菌；張鐵華等[20]研究發(fā)現(xiàn)無包裝鮮牛肉貯藏過程中G-桿菌為主要菌系，真空包裝鮮牛肉中主要菌系的G+球菌，說明不同包裝形式貯藏的牛肉菌相會有所不同。Xiong[23]研究得出保鮮袋包裝冷卻牛肉中優(yōu)勢菌為假單胞菌和希瓦氏菌屬，在4 ℃條件下，貨架期為5 d。XU 等[24]研究得出普通包裝和氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）包裝冷卻牛肉中假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為優(yōu)勢菌群。保鮮盒包裝并不是密封包裝，也會有一定的透氧率，嗜冷菌假單胞菌G-桿菌，專性需氧，比較適于生長，為冷鮮牛肉貯藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌[25]；熱死環(huán)絲菌為微需氧菌，乳酸菌為兼性厭氧菌，也是主要腐敗菌。

2.2.2 冷鮮牛肉菌相的初步鑒定

菌落形態(tài)特征及初步鑒定結(jié)果見表3。

表3 菌落形態(tài)特征與生化試驗結(jié)果Table 3 Colony morphology and biochemical test results

由表3可知，經(jīng)菌落觀察及生化試驗鑒定4 種選擇性培養(yǎng)基中生長菌分別為假單胞菌屬/乳桿菌、熱死環(huán)絲菌及腸桿菌科。

3 結(jié)論

保鮮盒包裝冷鮮牛肉貯藏期第1 天時與鮮肉無顯著差異；貯藏第3 天時，肉樣的pH 值、TVB-N 值、TBARS 值以及菌落總數(shù)、大腸菌群均顯著增加，但肉樣仍比較新鮮；貯藏第5 天時肉樣為次鮮肉，第7 天時肉樣各項指標均已超標，且感官評分較低，成為腐敗肉。說明保鮮盒包裝冷鮮牛肉在0 ℃～4 ℃條件下貯藏時間需控制在5 d 內(nèi)，最適貯藏期為3 d。這與程述震[26]結(jié)論是一致的。通過指標相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，pH 值與TVB-N 值呈極顯著正相關(guān)，均與菌落總數(shù)呈顯著正相關(guān)，說明三者都能很好的反映肉品的新鮮度。肉樣感官品質(zhì)評分與pH 值、TVB-N 值、菌落總數(shù)呈極顯著負相關(guān)，說明肉品的品質(zhì)與肉品的新鮮度密切相關(guān)，通過測定肉品鮮度指標可反映肉品質(zhì)；TBARS 值與pH值、TVB-N 值及菌落總數(shù)呈顯著相正相關(guān)，與感官品質(zhì)呈顯著負相關(guān)，說明TBARS 值也能很好的反應(yīng)肉品質(zhì)。另外，通過初步菌相分析得出，在0 ℃～4 ℃貯藏的條件下，保鮮盒包裝冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌有假單胞菌、熱死環(huán)絲菌和乳酸菌。本研究為冷鮮牛肉生產(chǎn)企業(yè)提供一定的數(shù)據(jù)指導，也為屠宰過程中牛胴全表面減菌技術(shù)及冷鮮牛肉保鮮技術(shù)的研究提供一定的理論依據(jù)。