燒傷大鼠血清對血管內皮細胞通透性的影響

段聲梁，胡子健，孟承穎，黃海良，蔣智永，蔣 薇，王 歡，余又新，孫業(yè)祥，方林森，胡德林

血管通透性增加是導致體液滲出、組織水腫、機體酸堿失衡和休克發(fā)生的重要因素，如何降低燒傷早期血管通透性、減少體液丟失對于預防燒傷早期組織器官損害均有重要意義。然而，燒傷后血管內皮細胞(endothelial cells，EC)通透性變化的機制及調控途徑目前尚不明了。該實驗通過燒傷大鼠血清干預血管EC，分別檢測EC通透性變化及細胞通透性相關基因內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、內皮因子受體A(endothelin receptor A，ETA)、ETB和帶狀閉合蛋白1(zona occluden-1，ZO-1)的mRNA和蛋白表達變化，探討燒傷大鼠血清對血管EC通透性的影響，為深入研究燒傷早期血管通透性改變的機制及為燒傷的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級雄性SD大鼠，體質量150～180 g，共20只，每組10只，正常飲食水，飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度在22～25 ℃，相對濕度60%～70%，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心；RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；實時熒光定量PCR (Real-time PCR，RT-PCR)反應試劑盒購自大連寶生物公司；ET-1、ETA、ETB和ZO-1抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠燒傷模型復制及血清留取 雄性SD大鼠，體質量150～180 g，適應性喂養(yǎng)7 d。參照人與動物燒傷面積換算公式，以人體燒傷面積30% Ⅲ度燒傷為標準，應用沸水燙傷法復制大鼠燒傷12 h模型。腹主動脈取血后留取血清，以備后續(xù)實驗所需。

1.2.2實驗分組 將原代培養(yǎng)的大鼠主動脈EC根據(jù)是否應用燒傷血清干預分為正常組和血清干預組，正常組僅為原代培養(yǎng)的大鼠主動脈EC，血清干預組為應用燒傷12 h大鼠血清干預大鼠原代主動脈內皮細胞24 h。

1.2.3細胞培養(yǎng) 應用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代大鼠主動脈EC，隔天換液、觀察細胞生長狀況，當細胞匯合度約為90%時，進行消化、傳代、種板，按1×105/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)細胞至匯合度為80%時，將培養(yǎng)基更換為無血清RPMI1640培養(yǎng)基，進行后續(xù)實驗。

1.2.4單層細胞通透性系數(shù)檢測 將大鼠主動脈EC按1×105/孔接種于24孔Transwell小室，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8 h待其形成細胞單層。正常組按常規(guī)進行換液，血清干預組加入燒傷12 h大鼠血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。雙層小室的頂室加入 FITC- albumin，底室加入D-Hank′s液，37 ℃、5% CO2孵育 45 min，吸取雙層小室的頂室和底室液體，在熒光分光光度計測定各樣品熒光強度，計算單層細胞通透性系數(shù)。

1.2.5RT-PCR 應用預冷的PBS洗滌細胞2～3次，參照細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。以總RNA為模板，參照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，使用ABI7500 RT-PCR 儀檢測相關基因的表達。RT-PCR反應程序為：95 ℃、5 s；60 ℃、34 s，設置循環(huán)數(shù)為40。以β-actin作為內參，采用2-△△Ct法比較分析各基因表達，PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6Western blot 應用RIPA細胞裂解液(強)提取細胞總蛋白，按30 μg/孔的標準加樣、電泳。轉膜結束后，封閉液封閉1.5 h，TBST洗膜3 min。參考抗體說明書進行操作，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。相應二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光、顯影。Quantity One灰度分析軟件檢測各目的蛋白灰度值，以β-actin為內參計算其相對表達量。

2 結果

2.1 燒傷大鼠血清干預對單層EC通透性的影響以正常組為對照，并將細胞通透系數(shù)均一化為100%，應用燒傷12 h大鼠血清干預大鼠原代主動脈內皮細胞24 h，熒光分光光度計比色法(檢測波長為488 nm)檢測正常組和血清干預組樣品的熒光強度值(OD488 nm)，計算單層EC膜通透性系數(shù)。結果顯示，與正常組比較，血清干預組熒光強度明顯增強，單層細胞通透性系數(shù)為(1.933±0.261)，單層細胞通透性系數(shù)為正常組的1.933倍，明顯升高(t=10.030，P<0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 燒傷大鼠血清干預對單層EC通透性的影響

2.2 燒傷大鼠血清干預對EC相關的mRNA表達影響應用燒傷12 h大鼠血清干預大鼠原代主動脈內皮細胞24 h，RT-PCR分別檢測血管通透性相關的ET-1、ETA、ETB和ZO-1的 mRNA表達變化，結果顯示：與正常組比較，血清干預組ET-1、ETA和ETB 的mRNA表達顯著升高(t=37.190，P<0.001；t=78.580，P<0.001；t=28.750，P<0.001)，而ZO-1的mRNA表達則明顯降低(t=13.400，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 燒傷大鼠血清干預對ET-1、ETA、ETB和ZO-1 mRNA表達的影響

2.3 燒傷大鼠血清干預對EC相關蛋白表達影響應用燒傷12 h大鼠血清干預大鼠原代主動脈內皮細胞24 h，Western blot分別檢測血管通透性相關的ET-1、ETA、ETB和ZO-1蛋白表達變化，結果顯示：與正常組相比，血清干預組ET-1(t=7.139，P=0.002)、ETA(t=6.343，P=0.003)和ETB (t=7.648，P=0.002)的蛋白表達顯著升高，而ZO-1(t=8.743，P=0.001)的蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 燒傷大鼠血清干預對ET-1、ETA、ETB和ZO-1 蛋白表達的影響

1：正常組；2：血清干預組；與正常組比較：**P<0.01

3 討論

燒傷后出現(xiàn)組織水腫、體液外滲的重要病理生理基礎是血管通透性的改變，而血管通透性的改變是EC損害的主要表現(xiàn)之一[1-2]，促炎性細胞因子、氧自由基等炎癥介質的釋放及相關轉導通路的活化是EC損傷的主要病理機制[3]。

目前針對減輕血管通透性的治療，尚無有效措施。血管通透性增高主要發(fā)生在微靜脈，而微靜脈的血管壁主要由EC、周細胞、基底膜和少量平滑肌細胞構成，其中血管EC在微靜脈通透性改變中起主要作用[3]。本研究顯示，將燙傷大鼠12 h血清干預大鼠的內皮細胞24 h，與正常組相比，血清干預組的EC細胞通透性系數(shù)明顯升高，表明燒傷血清干預后的血管EC的通透性明顯增加。

ET-1是由血管的EC合成和分泌，是一種縮血管的多肽類物質[4]，燒傷后引起EC的缺血缺氧，是ET-1分泌的強烈刺激因素，并加重局部和全身循環(huán)的損害，ET-1在生物體內主要存在兩種受體：ETA 和ETB[5]。近幾年來針對血管通透性方面的研究，主要有EC間裂隙、穿細胞通道途徑、與緊密連接相關蛋白的發(fā)現(xiàn)、細胞骨架的重構和應力纖維的形成、骨架蛋白的磷酸化等[6]。其中EC的收縮性改變是各種因素引起血管通透性增加的共同通路，而EC的裂隙是血管通透性增高和大分子物質透出的重要途徑，內皮間的連接及相關蛋白是當前研究熱點之一，緊密連接是由特異蛋白使相鄰的兩個EC之間的間隙完全閉鎖，而ZO-1是參與緊密連接的重要蛋白之一[7-8]。本研究顯示，血清干預組的血管通透性相關因子ET-1、ETA、ETB表達升高，ZO-1表達降低，Chu et al[9]研究發(fā)現(xiàn)使用濃度為20%的燒傷血清培養(yǎng)的人臍靜脈EC間隙增加，即臍靜脈的EC通透性增強，表明燙傷大鼠血清能夠增加血管EC的通透性，燙傷大鼠血清中可能存在某種因子調控ET-1、ETA、ETB和ZO-1的表達，使血管EC的結構發(fā)生改變，導致了血管EC通透性的增加。

綜上所述，本實驗通過燙傷大鼠血清干預血管EC，結果顯示血管EC的通透性顯著增加，血管通透性相關因子ET-1、ETA、ETB和ZO-1表達發(fā)生改變，具體作用機制需要進一步深入研究。