百合配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚 娜，黃燕明，陳桂生，李雪銀，康志英

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.隆德縣六盤山 中藥資源開發(fā)有限公司， 寧夏 固原 756300)

百合配方顆粒是以百合飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒、包裝等工藝制備而成。原料百合為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.、百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker或細葉百合LiliumpumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，秋季采挖，洗凈，剝?nèi)△[葉，置沸水中略燙，干燥。其具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效，臨床上用于陰虛燥咳、勞嗽咳血、虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚[1-2]。百合是中藥的藥食同源植物，主要分布于北溫帶和亞熱帶地區(qū)。百合的鱗莖主要含有甾體皂苷、甾醇、酚酸甘油酯、黃酮、苯丙素、生物堿和多糖類等化合物[3-5]。研究表明，百合具有止咳祛痰、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗應激損傷、抗抑郁、降血糖及抑菌等藥理作用[6-8]。

1 儀器與試藥

萬分之一電子分析天平(ME204，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent1260 高效液相色譜儀(德國Agilent公司，G1311B單四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315D檢測器、OPENLAB CDS ChemStation Edition 數(shù)據(jù)處理軟件)；Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國Dionex公司，LPG-3400SDN單四元泵、WPS-3000SL自動進樣器、TCC-3000RS柱溫箱、DAD-3000檢測器、Chromeleon7.2數(shù)據(jù)處理軟件)；色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

百合對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，121100-201304，規(guī)格：1 g)；乙腈、甲酸為色譜級；甲醇為分析純。

10批百合配方顆粒均來自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號依次為01～10，規(guī)格為1.0 g/袋)；麥芽糊精來自湖州展望藥業(yè)有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

參考相關文獻[9-11], 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，按表1的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃；流速為0.6 mL/min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照溶液制備

取百合對照藥材4 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至近干，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取百合配方顆粒約1 g，研細，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理15 min(頻率40 kHz，功率250 W)，放冷，濾過，濾液濃縮至近干，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定法

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。

2.5 10批樣品的檢測結果

分別取10批百合配方顆粒，按“2.3”項下方法制備10份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，得到10批百合配方顆粒的色譜疊加圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》對10批百合配方顆粒指紋圖譜進行計算，相似度達0.99以上。結果見圖1、表2、圖2。

圖1 10批百合配方顆粒指紋圖譜疊加圖

批號01020304050607080910對照指紋圖譜011.0000.9991.0001.0001.0000.9971.0000.9990.9990.9980.999020.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000031.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0000.9991.000041.0001.0001.0001.0001.0000.9981.0000.9991.0000.9991.000051.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0000.9991.000060.9970.9990.9990.9980.9991.0000.9971.0000.9991.0000.999071.0000.9991.0001.0001.0000.9971.0000.9990.9990.9980.999080.9991.0001.0000.9991.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000090.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000100.9981.0000.9990.9990.9991.0000.9981.0001.0001.0001.000對照指紋圖譜0.9991.0001.0001.0001.0000.9990.9991.0001.0001.0001.000

2.6 指紋圖譜中共有峰確認

通過對10批廣州市香雪制藥股份有限公司生產(chǎn)的百合配方顆粒進行分析，并與百合對照藥材進行比對，有6個色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，且峰面積占總面積的比例均大于3%，故確立了6個共有峰。其中，2號峰、6號峰的峰面積占總面積的比例均大于10%，峰純度較純，故2、6號峰為特征峰。

圖2 百合配方顆粒指紋圖譜共有模式

2.7 指紋圖譜方法學考察

2.7.1 專屬性試驗 取百合配方顆粒、麥芽糊精分別按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果表明，6個共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專屬性。

2.7.2 精密度試驗 取同一批百合配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》進行相似度評價，各圖譜共有峰與對照指紋圖相似度均大于0.990 0，表明該儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗 取同一批百合配方顆粒樣品，平行6份，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，各圖譜特征峰的相似度均大于0.990 0，表明該方法重復性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份百合配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進樣，記錄色譜圖，結果各圖譜共有峰的相似度均大于0.990 0，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 中間精密度試驗 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設備對精密度的影響，結果各圖譜共有峰的相似度均達0.9900以上，表明該方法中間精密度良好，隨機變動因素不影響該方法精密度。

2.7.6 耐用性實驗 取同一批百合配方顆粒供試品，按“2.3”項下方法處理樣品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、WelchUltimateXB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號的色譜柱，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，結果在不同色譜柱因素變動的條件下，各圖譜共有峰的相似度均達0.990 0以上，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本實驗對不同實驗條件進行優(yōu)化，考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-水等流動相體系；柱溫分別選用20、25、30 ℃；全波長掃描考察了不同波長下供試品的指紋圖譜。最終選取在柱溫25 ℃下，檢測波長為280 nm，以乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脫，該條件下譜圖色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性好。

在色譜柱的選擇中，根據(jù)百合配方顆粒樣品中的成分類別及理化性質(zhì)，選用C18柱進行分離，分別考察了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號的色譜柱，各色譜峰均能達到基本分離，各型號色譜柱分離效果符合要求。

通過相似度計算軟件[12]得到10批百合配方顆粒的對照圖譜及各批樣品與對照圖譜之間的相似度，結果均大于0.990 0，表明各批次樣品之間相關性較好，投料所用的百合原藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，百合配方顆粒工藝穩(wěn)定。

本實驗中建立的采用HPLC檢測百合配方顆粒指紋圖譜方法穩(wěn)定性、重復性好、簡便，能比較全面地反映百合配方顆粒的質(zhì)量，可作為百合配方內(nèi)控顆粒質(zhì)量標準。