miR-143-3p通過靶向TAK1抑制肺癌增殖和侵襲

廉亮亮，齊書山，袁洪志

北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院 胸心血管外科，北京 102400

2018年全球癌癥統(tǒng)計報告表明，肺癌發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。腫瘤異質(zhì)性和預(yù)后不良是導(dǎo)致肺癌患者高死亡率的主要原因，近幾年雖然肺癌的診斷治療取得了實質(zhì)性進(jìn)展，但肺癌的整體5年生存率仍不超過18%[2]。因此，探究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，為肺癌提供更新的治療策略是十分必要的。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類包含19～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可以通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。據(jù)報道，miRNA可以在包括肺癌在內(nèi)的不同疾病中，作為致癌基因或腫瘤抑制因子[4]，如miR-17-92[5]、miR-21[6]、miR-548a-5p[7]、miR-425-5p[8]促進(jìn)肺腫瘤發(fā)生，而 miR-19a-3p[9]、miR-33a-5p[10]、miR-466[11]和 miR-577[12]充當(dāng)腫瘤抑制因子。

研究顯示，miR-143-3p通過靶向調(diào)控基因表達(dá)影響癌癥的發(fā)生發(fā)展，如在膀胱癌和結(jié)直腸癌中，miR-143-3p通過靶向細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5/蛋白激酶 B（ERK5/Akt）[13]或者通過抑制 KRAS 翻譯[14]來抑制腫瘤發(fā)展；miR-143-3p通過靶向調(diào)控整合素α6（integrin alpha 6，ITGA6）和錨蛋白重復(fù)及PH結(jié)構(gòu)域3（ankyrin repeat and PH domain 3，ASAP3）表達(dá)抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[15]。我們檢測了miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況以及對肺癌細(xì)胞功能的影響，并探究了miR-143-3p對轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor beta-activated kinase 1，TAK1）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2018-03-14～2019-03-14在北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院普外科手術(shù)治療的10例肺癌患者，每例分別取肺癌組織和癌旁組織；人肺癌細(xì)胞系HCC27、H1975、A549，人正常肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；miR-143-3p mimics和miR-143-3p抑制劑anti-miR-143-3p購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green染料購自TaKaRa公司；All-in-one miRNA qRT-PCR檢測試劑盒和miR-143-3p、U6的引物購自GeneCopoeia公司；凝膠成像儀和化學(xué)顯色液購自Bio-Rad公司；TAK1抗體、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的二抗購自Abcam公司。

1.2 miR-143-3p腫瘤組織表達(dá)分析

利用starBase在線分析平臺挖掘來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的肺癌miR-143-3p表達(dá)譜。

1.3 總RNA提取和實時熒光定量PCR

TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。用All-in-one miRNA qRT-PCR檢測試劑盒檢測miR-143-3p的表達(dá)，以U6為內(nèi)參。用2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測目的基因的相對含量，并以GAPDH為內(nèi)參，通過 CT（2-ΔΔCt）方法將基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。各基因qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，取miR-143-3p mimics和anti-miR-143-3p各50 nmol/L轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為陰性對照組（NC）、轉(zhuǎn)染組（miR-143-3p mimics）、轉(zhuǎn)染組（miR-143-3p mimics+anti-miR-143-3p）。

1.5 CCK-8實驗

CCK-8法檢測3個處理組肺癌細(xì)胞的活力。取對數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，每孔接種2×103細(xì)胞，在培養(yǎng) 1、2、3 d后，每孔分別加入 10 μL CCK-8，溫育4 h后測定每孔的D450nm值，以時間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.6 細(xì)胞遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板中，并在孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為下液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室。用甲醇固定15 min，DPAI染色10 min，PBS清洗后在熒光顯微鏡下觀察，拍照，計數(shù)。

1.7 細(xì)胞侵襲實驗

取出凍存的Matrigel基質(zhì)膠，4℃過夜融化，取適量預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按1∶5稀釋Matrigel膠，混勻后加入Transwell小室中。其余步驟同Transwell遷移實驗。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測TAK1蛋白表達(dá)水平

取適量RIPA蛋白裂解液在冰上裂解收集的細(xì)胞，離心收集上清，測定蛋白質(zhì)濃度，制備蛋白上樣液，用10%SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束后，恒流電轉(zhuǎn)至PDVF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉后，將膜與TAK1抗體、GAPDH抗體一起孵育。以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，化學(xué)顯色液顯色后，放至凝膠圖像分析儀中成像。

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD檢驗方法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-143-3p在肺癌組織中的表達(dá)

通過starBase對TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)miR-143-3p在肺癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)中包括512例肺腺癌和475例肺鱗癌，相應(yīng)癌旁正常組織作為對照樣本。結(jié)果顯示，無論在肺腺癌組織中還是在肺鱗癌組織中，miR-143-3p的表達(dá)量均明顯低于相應(yīng)對照組織中的表達(dá)；此外，還檢測了miR-143-3p在10例肺癌患者中的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)miR-143-3p在腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織中的表達(dá)。這說明miR-143-3p可能在肺癌中發(fā)揮著重要作用。結(jié)果見圖1。

圖1 miR-143-3p在肺癌組織中的表達(dá)特點（**P＜0.01）

2.2 miR-143-3p在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR檢測3個肺癌細(xì)胞系中miR-143-3p的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖2，miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于在正常細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)，這與miR-143-3p在肺癌組織中的表達(dá)情況一致。

2.3 miR-143-3p對肺癌細(xì)胞增殖活力的影響

選取肺癌細(xì)胞H1975、A549檢測miR-143-3p表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果見圖3。NC對照組和miR-143-3p+anti-miR-143-3p組肺癌細(xì)胞增殖活力均顯著高于miR-143-3p組，說明miR-143-3p抑制肺癌細(xì)胞的增殖活力。

圖2 qRT-PCR檢測miR-143-3p在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)（*P＜0.05）

圖3 CCK-8法測定miR-143-3p表達(dá)對肺癌細(xì)胞H1975、A549活力的影響（*P＜0.05）

2.4 miR-143-3p對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

采用Transwell法進(jìn)一步探究miR-143-3p過表達(dá)對肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響，結(jié)果見圖4。在2種肺癌細(xì)胞系中，miR-143-3p組的遷移和侵襲相對活力顯著低于NC對照組和miR-143-3p+anti-miR-143-3p組，而NC對照組和miR-143-3p+anti-miR-143-3p組間沒有顯著差異，說明miR-143-3p過表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

2.5 miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中對ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1表達(dá)的影響

已有研究顯示，miR-143-3p可以靶向調(diào)控ITGA6、ASAP3抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[15]，也可以靶向調(diào)控黑色素瘤相關(guān)抗原A9（melanoma-associated antigen-A9，MAGE-A9）抑制喉部鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲[16]，還可以靶向調(diào)控TAK1表達(dá)抑制卵巢癌的進(jìn)展[17]。因此，我們檢測了在肺癌細(xì)胞系 H1975、A549中 miR-143-3p對 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1表達(dá)的影響。從圖5可以看出，miR-143-3p能夠使 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的表達(dá)均降低，但其中對TAK1表達(dá)的影響最為顯著。

2.6 miR-143-3p在肺癌細(xì)胞中對TAK1蛋白表達(dá)的影響

圖5顯示，miR-143-3p對TAK1 mRNA表達(dá)影響最為顯著，因此相應(yīng)檢測了miR-143-3p對TAK1蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果見圖6。與對照相比，miR-143-3p過表達(dá)顯著降低了TAK1蛋白的表達(dá)，但miR-143-3p抑制劑處理后，TAK1蛋白表達(dá)水平又恢復(fù)至對照水平。該結(jié)果說明在肺癌細(xì)胞中miR-143-3p可以抑制TAK1的表達(dá)。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居全球癌癥發(fā)病和死亡的首位，而我國肺癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別占全球的37%、39.2%[18]。雖然近年在肺癌診斷和治療方面取得了一些進(jìn)展，但肺癌的預(yù)后仍然不理想。探究肺癌發(fā)生發(fā)展機制，為肺癌的診斷和治療提供新的思路和靶標(biāo)是十分必要的。

本研究表明，肺癌細(xì)胞中的miR-143-3p表達(dá)水平低于肺正常上皮細(xì)胞，同時我們通過starBase分析TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-143-3p在肺癌組織中的表達(dá)和檢測肺癌患者組織樣品發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p在肺癌組織中的表達(dá)水平也低于正常肺組織，與細(xì)胞中的檢測結(jié)果一致。這提示miR-143-3p可能在肺癌進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步探究miR-143-3p對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，我們通過CCK-8實驗、Transwell遷移和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p過表達(dá)抑制了肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-143-3p可以作為腫瘤抑制因子，這為肺癌腫瘤治療提供了新的思路。

為了探討miR-143-3p抑制肺癌細(xì)胞進(jìn)展的機制，我們通過qRT-PCR檢測ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-143-3p過表達(dá)后，肺癌細(xì)胞中 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的mRNA表達(dá)水平均降低，但其中對TAK1表達(dá)的影響最顯著。進(jìn)一步采用蛋白免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)miR-143-3p同樣也顯著抑制TAK1蛋白表達(dá)水平。TAK1屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）家族，參與控制各種細(xì)胞系統(tǒng)中p38MAPK和JNK的激活[19]。TAK1是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20]，TAK1的缺失會導(dǎo)致JNK和NF-κB信號傳導(dǎo)失活，后兩者都在細(xì)胞存活和增殖中起關(guān)鍵作用[21]。因此，miR-143-3p可能通過調(diào)控TAK1的表達(dá)來影響肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖4 Transwell法測定miR-143-3p表達(dá)對肺癌細(xì)胞H1975、A549侵襲/遷移的影響（*P＜0.05）

圖5 qRT-PCR檢測miR-143-3p在肺癌細(xì)胞H1975、A549中對ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1 mRNA表達(dá)的影響

圖6 Western印跡檢測肺癌細(xì)胞中miR-143-3p對TAK1蛋白表達(dá)水平的影響

綜上，miR-143-3p在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，可以作為腫瘤抑制因子，通過調(diào)控TAK1的表達(dá)來影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-143-3p為改善肺癌預(yù)后提供了新的思路，但miR-143-3p在肺癌進(jìn)展中詳細(xì)的分子作用機制和信號通路仍須進(jìn)一步探究。