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    未知茵的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究

    2019-07-15 01:02:15王薪龔維瑤陳宜濤林美愛
    科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2019年12期
    關(guān)鍵詞:抑菌活性

    王薪 龔維瑤 陳宜濤 林美愛

    摘要:在活化培養(yǎng)放線菌A45時(shí),發(fā)現(xiàn)原平板上放線菌有被抑制現(xiàn)象,通過進(jìn)一步分離培養(yǎng)及接種,確定其確有抑制放線菌A45的能力。為了研究該菌的抑菌效果,通過有機(jī)試劑乙酸乙酯萃取該菌發(fā)酵液,制備濾紙片,發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液對(duì)甲型副傷寒桿菌和表皮葡萄球菌抑菌能力較好。通過微量肉湯稀釋法測定其最低抑菌濃度,可得該菌產(chǎn)生的抑菌成分對(duì)表皮葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為8mg/mL,對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌濃度為16mg/mL。最后通過薄層層析最佳流動(dòng)相的測定探索出兩個(gè)較好的系統(tǒng),分別為甲醇:正丁醇:冰乙酸:蒸餾水=9:7:1:2(體積),正丁醇:乙醇:蒸餾水=3:7:7(體積)。

    關(guān)鍵詞:未知菌;抑菌活性;最低抑菌濃度;分離系統(tǒng)

    中圖分類號(hào):Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-2945(2019)12-0056-03

    本研究基于學(xué)生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象進(jìn)行進(jìn)一步主動(dòng)探索。由于該菌可生長在放線菌A45平板中,暫認(rèn)為該菌與放線菌A45需相同的生活環(huán)境。對(duì)于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的新菌種,如能及時(shí)采取對(duì)其的純化培養(yǎng)和確認(rèn),可能會(huì)對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)及研發(fā)帶來有利影響。但該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)停留在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究層面,還需進(jìn)一步進(jìn)行PCR測序?qū)嶒?yàn),確定該菌真實(shí)身份。

    1實(shí)驗(yàn)材料

    1.1試劑

    三氯甲烷(浙江迪耳藥業(yè)有限公司)、乙酸乙酯(華東醫(yī)藥股份有限公司)、石油醚、正丁醇(成都市科龍化工試劑廠)、牛肉膏(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品)、蛋白胨(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)、氯化鈉(上海試四赫維化工有限公司)、瓊脂(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、可溶性淀粉(南京化學(xué)試劑有限公司)、硝酸鉀(無錫市東晶化學(xué)試劑有限公司)、磷酸氫二鉀(西隴化工股份有限公司)、七水硫酸鎂(無錫市佳妮化工有限公司)、七水硫酸亞鐵(巨化集團(tuán)公司試劑廠)。

    1.2儀器

    精密電子天平(型號(hào):PB203-N,梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司);4℃冰箱(BCD-205E/Y,海爾集團(tuán));蘇泊爾微電磁爐(型號(hào):C19A01-A,浙江蘇泊爾股份有限公司);智能生化培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器);振蕩培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(型號(hào):YXQ-LS,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);無菌操作臺(tái)(型號(hào):JB-VS-840U,蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司);精密試紙(pH 6.4-8.0,上海三愛思試劑有限公司);可調(diào)微量鎖緊移液器(型號(hào):WKYⅣ-5,上海佳音分析儀器廠);燒杯(50mL、100mL、500mL、1000mL和2000mL);量筒(50mL、100mL、250mL和1000mL);錐形瓶(100mL、250mL和500mL);分液漏斗(250mL);10mL移液管;紗布;微量移液器和槍頭(20lxL,200uL和1000uL);接種環(huán);酒精燈;脫脂酒精棉;培養(yǎng)皿;玻璃棒。

    1.3培養(yǎng)基

    牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,NaCI5g/L,瓊脂18g/L,pH 7.4-7.6。

    高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g/L,KN03 1g/L,K2HPO4 0.5g/L,MgSO4-7H2O 0.5g/L,NaCI 0.5g/L,F(xiàn)eSO4-7H2O 0.mg/L,瓊脂18g/L,pH 7.4-7.6。

    液體培養(yǎng)基均是上述配方不加瓊脂。

    1.4菌種

    放線菌A45,枯草芽孢桿菌,甲型副傷寒桿菌,大腸桿菌,表皮葡萄球菌,傷寒桿菌,痢疾桿菌,金黃色葡萄球菌(均由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

    2實(shí)驗(yàn)方法

    2.1未知菌株的發(fā)現(xiàn)

    無菌條件下,培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室保存的放線菌A45,從中挑取未知菌種進(jìn)行分離純化培養(yǎng),挑取純化的單個(gè)菌落,點(diǎn)在密集劃線的正常放線菌A45平板上,放培養(yǎng)箱28℃倒置培養(yǎng)48h觀察。

    2.2未知菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

    無菌條件下,挑取未知菌株單個(gè)菌落接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)液,置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以200r/min 28℃振蕩培養(yǎng)4d。待大部分孢子成熟后,即可用于發(fā)酵培養(yǎng)。按照8%(20mL)的接菌量接種于新的高氏一號(hào)培養(yǎng)液中,置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以200r/min 28℃振蕩培養(yǎng)4d。

    2.3抑菌活性物質(zhì)的萃取濃縮

    將澄清的發(fā)酵液用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。加入1/4體積的有機(jī)溶劑,充分?jǐn)嚢韬箪o置4h,收集有機(jī)相和水相,用濾紙片法檢測各相萃取液的抑菌活性,將有活性相萃取三次后分別合并。將合并相于70℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4活性物質(zhì)的抑菌實(shí)驗(yàn)

    2.4.1濾紙片法

    無菌條件下,用無菌鑷子夾取直徑為5mm的圓形無菌濾紙片分別放入需檢測的溶液中,充分浸泡,2h后取出無菌風(fēng)干,備用。將活化好的供試菌株密集劃線接種于無菌平板上,用鑷子夾取風(fēng)干的濾紙片放在接種的平板上。放入培養(yǎng)箱。37℃倒置培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。

    2.4.2微量肉湯稀釋法

    無菌操作,將制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液,經(jīng)肉湯1:1000稀釋后分別加到無菌96孔聚苯乙烯板中的第1-11孔,每孔中加180ul。將不同濃度梯度的粗提物溶液分別加到上述1-10孔中,每孔20ul,第11孔不加粗提物作為生長對(duì)照。使第1-11孔最終粗提物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0mg/ml,將96孔板密封后置35~C普通空氣孵育箱中,孵育24h,用酶標(biāo)儀在630nm處檢查吸光度值,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    2.5抑菌成分分離

    展層劑于展層缸中飽和。毛細(xì)管將樣品點(diǎn)樣到薄層層析硅膠板上,點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不超過2mm,單次點(diǎn)樣,樣點(diǎn)距薄層一端約1cm。將硅膠板放入已飽和的層析缸中展開,當(dāng)展層溶劑上行到距硅膠板另一端邊緣1cm處時(shí)取出,放置于空氣中自然干燥,紫外燈下觀察其條帶情況。通過選取不同展層劑對(duì)樣品進(jìn)行分離,確定樣品的最適展開條件。

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