視網(wǎng)膜母細胞瘤斑馬魚模型及rb1基因研究進展

王俐梅, 張 建, 劉忠華, 楊 威

(1. 廣東省生物資源應(yīng)用研究所, 廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室, 廣州510260;2. 華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院, 廣州510642; 3. 廣州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院, 廣州 511436;4. 廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司, 廣東省藥物非臨床評價研究企業(yè)重點實驗室, 廣州 510990)

視網(wǎng)膜母細胞瘤(Retinoblastoma, RB)是一種常見的發(fā)生于嬰幼兒眼內(nèi)的原發(fā)惡性腫瘤[1,2]。目前RB發(fā)病的機制主要包括染色體遺傳、染色體突變、病毒感染等。對于RB發(fā)生的共識性觀點是： 由視網(wǎng)膜母細胞中rb1雙等位基因突變引發(fā)RB蛋白磷酸化缺陷, RB蛋白活性的喪失導致細胞周期受損和細胞增殖失控引起的[3], RB蛋白是參與細胞周期發(fā)展、終末分化和DNA復制的主要腫瘤抑制基因[4-6]。世界衛(wèi)生組織[7]統(tǒng)計表明, RB發(fā)病率較低, 全世界平均每16 000～18 000新生兒中只有1例發(fā)生RB, 但我國RB患兒的生存率僅為63%, 遠低于發(fā)達國家95%的生存率, 因此我國對于RB的研究亟待加強。

雖然RB的發(fā)病率較低，但RB的治療在世界范圍內(nèi)仍然是一個難題，為保住患者生命，往往只能采取眼球摘除或者眼眶內(nèi)容剜出術(shù)。盡管大多數(shù)RB患兒存活下來，但他們通常會永久失去視力，因此如何在治愈腫瘤的同時保住眼球和視力成為研究目標，早發(fā)現(xiàn)、早診斷是避免手術(shù)治療RB疾病的最佳途徑。近幾年基因檢測和編輯技術(shù)快速發(fā)展，共識性的觀點是在不遠的未來，人類有可能通過基因編輯的方法治療疾病。最近研究[7-11]表明，現(xiàn)有分子生物學及分子遺傳學方法已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)rb1基因突變檢測。我國在相關(guān)研究方面也有明顯進展，孟慶娛等[12]利用基因捕獲技術(shù)成功篩選出了視網(wǎng)膜母細胞瘤患者的rb1突變基因，蘭小平等[13]采用Sanger測序與多重連接探針擴增技術(shù)相結(jié)合的策略探索了母系遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤家系rb1基因分析與產(chǎn)前診斷。

成功構(gòu)建RB動物模型是進一步開展相關(guān)研究的必備條件，傳統(tǒng)的模式動物在發(fā)揮重要作用的同時，基因編輯相關(guān)的科學研究從實驗便利性、繁殖率、繁殖速率和成本等方面對模式動物提出了新的需求，在這樣的背景下斑馬魚以其獨特的優(yōu)點，已經(jīng)成為了一種引發(fā)廣泛關(guān)注的新興模式動物。

1 RB斑馬魚模型與其他動物模型的比較分析

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio)與人類基因同源性高達85%，其信號傳導通路與人類基本近似，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動物高度相似，且斑馬魚具有飼養(yǎng)成本低、體積小、發(fā)育周期短、體外受精、透明易觀察和單次產(chǎn)卵數(shù)較高等優(yōu)點[14]。目前斑馬魚已被美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)列為繼人和小鼠之后的第三大模型動物?；谝陨巷@著優(yōu)點，斑馬魚已經(jīng)應(yīng)用于以下幾個癌癥研究領(lǐng)域： ①使用化學致癌, 遺傳和異種移植的方法建立癌癥模型; ②用評估腫瘤血管生成; ③研究腫瘤轉(zhuǎn)移; ④抗腫瘤藥物篩選和藥物毒性評價[15,16]。 RB發(fā)病機制研究及治療藥物的研發(fā)都需要合適的動物模型。已經(jīng)報道[17-25]可以用于構(gòu)建RB模型的動物有小鼠、大鼠、兔、非洲爪蟾、斑馬魚等, 以上動物模型存在各自的優(yōu)缺點。本文對現(xiàn)有RB動物模型的總結(jié)見表1。

雖然斑馬魚RB模型研究尚處于起步階段，但已經(jīng)有了較多的發(fā)現(xiàn)。最近研究[29]表明，通過斑馬魚模型可以從單個細胞水平上監(jiān)測到標記后的RB細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，且實現(xiàn)了實時動態(tài)監(jiān)測，從而為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和藥物作用的相關(guān)研究提供了一個新的思路。本文將綜述現(xiàn)有的RB斑馬魚模型的建立方法以及基于這些模型取得的研究進展，以促進RB相關(guān)的研究。

2 構(gòu)建RB斑馬魚模型的方法

2.1 異種移植RB斑馬魚模型

Hyun 等[25]建立了一種異種移植RB斑馬魚模型,具體做法是： 在斑馬魚卵受精48 h后, 將RB細胞注入斑馬魚胚胎的玻璃體腔。由于斑馬魚胚胎很小且具有光透明性，在胚胎期可以利用共聚焦激光顯微鏡對斑馬魚的眼球成像，進而能夠通過圖像中綠色熒光蛋白(GFP)的強度定量地分析腫瘤細胞群。在不使用藥物的情況下隨著注射的RB細胞數(shù)量增加,眼球中GFP強度增強, 預(yù)示著腫瘤群體變大。將斑馬魚模型飼養(yǎng)在含有藥物Carboplatin和Melphalan的林格氏液中, 結(jié)果顯示特定濃度的藥物Carboplatin和Melphalan能夠分別降低GFP的表達強度30%和28%,這個結(jié)果預(yù)示斑馬魚模型可以用于篩選抗癌藥物。

表1 RB動物模型建模方法和特點分析Table 1 Modeling methods and characteristics of animal models of retinoblastoma

Chen等[26]建立了另一種類型的異種移植RB斑馬魚模型，方法是：將紅色染料標記的人RB細胞(RB355)和小鼠(SJmRBL-8)細胞植入斑馬魚胚胎的玻璃體內(nèi)，所使用的斑馬魚的血管內(nèi)皮細胞能夠表達GFP。由于采用了雙色標記, 能夠看到腫瘤細胞和周圍微血管之間的相互作用，腫瘤細胞附著于血管形成簇, 先是關(guān)聯(lián)增強, 然后關(guān)聯(lián)減少, 說明微血管系統(tǒng)可能是腫瘤侵襲的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進一步使用藥物Vegf-aamorpholino和Sunitinib對含有RB的斑馬魚胚胎進行了治療, 結(jié)果表明藥物Vegf-aamorpholino和Sunitinib能夠顯著降低轉(zhuǎn)移細胞的數(shù)量和頭部腫瘤直徑，說明這兩種藥物顯著減弱了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果預(yù)示著斑馬魚模型可以用于侵襲性疾病的治療研究。

2.2 基因突變RB斑馬魚模型

Gyda等[27]報道了一種自發(fā)性rb1基因突變的斑馬魚。他們首先對基因突變斑馬魚使用PCR方法進行基因序列分析，然后用染料DiI 或DiO對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進行標記，接著通過免疫組織化學方法判斷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在細胞周期中的延遲情況。由于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中可以表達GFP熒光，因而通過共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜構(gòu)造軌跡，可以推斷出軸突發(fā)展的情況。通常情況下，新生野生型斑馬魚胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突先于視網(wǎng)膜引背蓋形成，而本研究結(jié)果顯示rb1突變后的斑馬魚，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化周期出現(xiàn)了延遲，導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞短暫不足，進一步導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突缺陷，從而引發(fā)視網(wǎng)膜連接異常和趨勢行為缺陷，使視神經(jīng)發(fā)育不全。盡管 rb1突變的斑馬魚，能夠最終建立基本的網(wǎng)膜連接，但是行為學分析表明，這些發(fā)生了rb1突變體的斑馬魚表現(xiàn)出明顯的視覺行為障礙。該研究表明這種罕見的rb1基因突變的斑馬魚會形成RB模型，從一種新的視角建立了一種 rb1基因的功能通路。

2.3 TALEN基因編輯RB斑馬魚模型

Solin等[28]使用TALEN基因編輯法構(gòu)建RB斑馬魚模型，具體方法是：將靶向rb1基因外顯子2和3的TALEN mRNA注入胚胎，經(jīng)過編輯的部分斑馬魚胚胎，在3.5個月時開始生長腫瘤。研究者先通過組織病理學染色對不同的腫瘤進行特點分析，進一步通過免疫組織化學法對腫瘤進行鑒定。結(jié)果顯示腫瘤發(fā)生部位不同，主要出現(xiàn)在大腦中并非視網(wǎng)膜，表現(xiàn)出了神經(jīng)外胚層樣和膠質(zhì)樣腫瘤的特征。該研究驗證了斑馬魚 rb1失活會導致癌癥，突出了位點特異性核酸酶對于創(chuàng)建基因嵌合斑馬魚的作用，便于研究癌癥中的 rb1功能。

Zhang等[29]使用TALEN基因編輯法建立了RB斑馬魚模型, 用于研究 rb1在T細胞發(fā)展過程中的作用機制。他們開發(fā)的TALEN mRNA能夠高效的靶向rb1基因的外顯子2，注射入斑馬魚胚胎后導致了F0代80%的等位基因丟失，F(xiàn)1代中得到了缺乏rb1蛋白的突變體。研究表明rb1基因通過抑制E2F1保護T細胞成熟免于過早凋亡。此外，Schultz等[30]也使用TALEN基因編輯法制作斑馬魚模型，并進一步選用誘導產(chǎn)生的大腦腫瘤用于研究，研究表明表觀遺傳調(diào)控因子Rbbp4和Hdac1在斑馬魚rb1胚胎腦腫瘤模型中過表達，是神經(jīng)祖細胞生存和增殖所必需的。

3 小結(jié)

由于我國仍然面臨RB疾病較低的治愈率和生存率，對于RB疾病的治療仍有很大的瓶頸，藥物的研發(fā)與評價顯得尤為重要，而斑馬魚作為新型RB模型為藥物研發(fā)與評價提供了新的選擇和思路。斑馬魚的選擇能夠大大提高藥物研發(fā)與評價工作效率, 因此斑馬魚應(yīng)用于RB模型中有極大的競爭力。

從以上內(nèi)容可以看出： ①異種移植法構(gòu)建原位RB斑馬魚模型，優(yōu)于其他方法，且操作可行性較高，能夠獲得確切目標的腫瘤模型，評價指標簡便; 使用熒光染色等方法能夠活體監(jiān)測腫瘤，有利于進一步用于藥物篩選研究。但是在腫瘤發(fā)生機制等研究中沒有進行深入研究。②基因突變法構(gòu)建腫瘤模型，揭示了rb1在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突和視覺行為中的新作用，為鑒定難以捉摸的RB細胞起源提供新的潛力，但是基因突變極少數(shù)能獲得RB斑馬魚模型，需要進一步研究其機制，此方法目前不適用于RB斑馬魚模型的構(gòu)建。③TALEN基因編輯法構(gòu)建腫瘤模型，成瘤不確定，在動物機體內(nèi)多個部位成瘤，但在視網(wǎng)膜未獲得腫瘤，需要進一步研究其機制，不適用于RB斑馬魚模型的構(gòu)建，但是研究證明了使用基因編輯核酸酶有助于快速大規(guī)模篩選斑馬魚中腫瘤抑制因子。

綜上所述，RB斑馬魚模型可以為開發(fā)防治RB藥物的成藥性評價提供關(guān)鍵支撐，有助于推進一線治療藥物的轉(zhuǎn)化。同時RB斑馬魚模型的研究工作可以為RB的侵襲、轉(zhuǎn)移及發(fā)病機理提供新見解，有助于推進標準化動物模型并建立相應(yīng)治療方法。此外, 從實驗動物福利和3R原則角度來看, 斑馬魚模型作為低等動物能更好替代高等動物, 有利于對斑馬魚模型進行深入研究，建立更好模型評價標準和藥物標準。然而目前RB斑馬魚模型研究尚剛剛起步，異體移植的方法相對比較成功的建立模型和評價指標, TALEN方法操作較為復雜, 模型構(gòu)建的成功率不是很高, 仍需要進一步深入研究。目前最新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9還未有用于建立RB斑馬魚模型的研究報道, 但我們相信該技術(shù)將在基因修飾RB斑馬魚模型的制備及研究中發(fā)揮作用。