奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

闞秋琪，劉康軍，孫瑩慧，李建基，崔璐瑩，孟霞，朱國(guó)強(qiáng)，王亨

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009 )

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最普遍、經(jīng)濟(jì)危害最嚴(yán)重的一種疾病，其病因復(fù)雜，通常由微生物引起，其中無乳鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌是最主要致病菌[1]。由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有治愈率低，復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。同時(shí)，抗生素的濫用導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的耐藥性愈來愈強(qiáng)，嚴(yán)重阻礙了奶牛業(yè)的發(fā)展。本試驗(yàn)對(duì)從江蘇某奶牛場(chǎng)乳房炎患牛奶樣中分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)，篩選出有效藥物，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 奶樣采集

經(jīng)臨床檢查和CMT檢測(cè)，共計(jì)從江蘇某奶牛場(chǎng)收集55份乳房炎患牛奶樣。

1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白胨和酵母提取物，購(gòu)自O(shè)XOID公司；Baird-Parker瓊脂，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸、基質(zhì)溶液和MALDI Biotyper微生物鑒定系統(tǒng)，購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離純化

將奶樣搖勻后接種于Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，然后觀察及記錄菌落的形態(tài)，挑取疑似金黃色葡萄球菌的菌落，即黑色、周圍有白色渾濁帶，且最外圍有一透明環(huán)的菌落，將其接種于LB固體瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌的鑒定

使用MALDI Biotyper系統(tǒng)對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。首先在MALDI靶板上加1μL質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，自然干燥，然后將純化后的單個(gè)菌落直接涂抹于其他位點(diǎn)，再加入70%的甲酸水溶液1μL，自然干燥，最后分別在質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和菌落涂層上加1μL基質(zhì)溶液，待其自然干燥后放入質(zhì)譜儀，通過Flex Control和MALDI Biotyper RTC 篩選出特異性的指紋圖譜，與Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，完成微生物的鑒定[2]。

1.5 耐藥性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)12種抗生素(青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、丁胺卡那、卡那霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、克林霉素)進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 耐藥性試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

本試驗(yàn)從55份乳房炎奶樣中共分離出8株金黃色葡萄球菌（編號(hào)分別為1～8），檢出率為14.55%(8/55)。

2.2 耐藥性試驗(yàn)

表2 8株金黃色葡萄球菌分離株的耐藥結(jié)果 單位：mm，%

采用紙片擴(kuò)散法對(duì)8株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了12種抗菌藥物的耐藥性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌對(duì)12種抗生素均存在一定程度的耐藥。其中，對(duì)青霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率最高，均為100%，其次，對(duì)阿莫西林的耐藥率也達(dá)到較高水平，為75%，極少數(shù)對(duì)頭孢氨芐、慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素耐藥，而8株金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素均敏感，對(duì)克林霉素敏感或中敏（表2）。

3 討論

在本次試驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的檢出率為14.55%。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，田曉英等[3]報(bào)道天津地區(qū)生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為58%，田會(huì)麗等[4]報(bào)道石河子地區(qū)的金黃色葡萄球菌檢出率為70.83%，兩者均高于本試驗(yàn)結(jié)果；但與章慧等[5]報(bào)道的上海生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率（13.33%）基本一致，Anderson等[6]報(bào)道的美國(guó)東南部地區(qū)牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率（13.6%）與本試驗(yàn)結(jié)果也基本一致，各地方的流行菌種不同可能是檢出率差異性顯著的原因。

本試驗(yàn)分離的8株金黃色葡萄球菌分離株均呈現(xiàn)多重耐藥，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素、阿莫西林)的耐藥水平極高，尤其對(duì)青霉素已產(chǎn)生完全耐藥性，高于高潮等[7]報(bào)道的上海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素的96.8%耐藥率，低于其報(bào)道的對(duì)阿莫西林的100%耐藥率；對(duì)氨基糖苷類抗生素中的鏈霉素達(dá)到完全的耐藥率，遠(yuǎn)高于劉敬蘭等[8]報(bào)道的北京地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對(duì)鏈霉素53%的耐藥率，而對(duì)慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素的耐藥率較低；對(duì)喹諾酮類抗生素中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率為100%，而對(duì)克林霉素敏感率達(dá)100%，前者耐藥率遠(yuǎn)高于王冰等[9]報(bào)道的呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥21%～32%的耐藥率；對(duì)頭孢類的頭孢氨芐的耐藥率為25%，遠(yuǎn)低于張倩等[10]報(bào)道的石河子地區(qū)的66.67%耐藥率；對(duì)四環(huán)素類抗菌藥耐藥率為0，遠(yuǎn)低于燕霞等[11]報(bào)道的浙江地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素60%的耐藥率。以上數(shù)據(jù)表明，各地區(qū)奶牛場(chǎng)的金黃色葡萄球菌分離株對(duì)各種抗生素的敏感程度存在很大差異，這可能是不同奶牛場(chǎng)不同用藥習(xí)慣所導(dǎo)致的。

本試驗(yàn)的8株金黃色葡萄球菌分離株均呈現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，其中對(duì)β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類的抗生素耐藥率極高，其原因可能與其所含耐藥基因的活躍表達(dá)有關(guān)。目前已有研究結(jié)果表明，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因?yàn)閙ecA、femA，氨基糖苷類耐藥基因?yàn)閍ac(6＇)/aph(2＇＇)，喹諾酮類耐藥相關(guān)基因?yàn)閚orA、gyrA、grlA，四環(huán)素類耐藥基因?yàn)閠etA、tetB、tetC、tetD，這些耐藥基因可使金黃色葡萄球菌極易產(chǎn)生耐藥性。不同地區(qū)、不同奶牛場(chǎng)的細(xì)菌耐藥性存在差異，臨床用藥時(shí)需根據(jù)實(shí)際情況合理用藥。

金黃色葡萄球菌能夠?qū)е氯橄偌?xì)胞損傷，并能在上皮細(xì)胞或者吞噬細(xì)胞（如嗜中性粒細(xì)胞）中存活，故控制該菌引發(fā)的乳房炎最有效的方法是保持環(huán)境衛(wèi)生、牛體清潔，減少或者消除牛群之間的傳播，減少乳頭污染和感染的機(jī)會(huì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病牛并隔離，通過細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)選擇敏感藥物進(jìn)行治療或者淘汰。此外，通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、補(bǔ)充維生素或者硒制劑[12,13]、平衡飼料中的銅和鋅的水平，均可以在一定程度上減少該疾病的發(fā)生。