Yap介導(dǎo)瑞芬太尼預(yù)處理促進(jìn)肝切除小鼠術(shù)后肝再生

殷蘇晴 朱 玲 楊瑜汀 崔 璀 高 雄 高 坡 焦英甫 楊立群

瑞芬太尼是臨床麻醉中常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥物。已有大量研究結(jié)果表明，瑞芬太尼對(duì)于肝臟手術(shù)過程中的相關(guān)臟器損傷具有一定的保護(hù)作用[1-2]，同時(shí)在一定程度上具有維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定、縮短機(jī)械通氣時(shí)間、保護(hù)肝功能等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。本課題組的前期研究首次闡明了瑞芬太尼對(duì)于肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制[5]。在肝再生模型中，70%肝切除后剩余的部分肝臟不可避免地遭受氧化應(yīng)激損傷，瑞芬太尼在肝切除后的肝再生過程中的作用尚無相關(guān)研究。本研究旨在探討瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)于70%肝臟切除術(shù)后肝再生的作用及其可能機(jī)制，為臨床圍術(shù)期應(yīng)用瑞芬太尼提供更多的依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，購(gòu)自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。Ki-67(#12202)、Yap(#14074)、磷酸化Yap(p-Yap，#4911)、GAPDH(#97166)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA生物科技有限公司，TRIzol和實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)的SYBR GREEN購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 70%肝切除模型的建立和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分入對(duì)照組和瑞芬太尼組。瑞芬太尼組小鼠在肝切除前20～30 min于腹腔內(nèi)注射瑞芬太尼30 μg/kg(劑量依據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)[6]結(jié)果)，對(duì)照組予等量0.9%氯化鈉溶液。之后用異氟烷麻醉小鼠，并采用改良Higgins和Anderson法行70%肝切除術(shù)。依據(jù)觀察時(shí)間點(diǎn)，分別在70%肝切除術(shù)后6、24、36、48、120、192 h收集小鼠的血清和肝臟標(biāo)本。

1.3 肝體比 分別于70%肝切除術(shù)后6、24、36、48、120、192 h取血后摘取兩組小鼠剩余30%的肝臟組織，計(jì)算肝體比。肝體比=相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)再生后的殘肝濕重/小鼠基本體重。

1.4 Ki-67免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ki-67陽性細(xì)胞率 取70%肝切除術(shù)后24、36、48、120、192 h的肝臟組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定脫水、石蠟包埋切片，而后脫蠟至水。用雙蒸水(ddH2O)清洗切片5 min×3次。將切片放入3%過氧化氫水溶液中，孵育10 min。用ddH2O清洗切片5 min×2次。用洗滌緩沖液清洗切片持續(xù)5 min。300 μL封閉液室溫下封閉1 h。300 μL一抗4 ℃孵育過夜。洗滌緩沖液清洗切片5 min×3次。在切片上滴加2或3滴SignalStain Boost Detection Reagent(HRP，Rabbit #8114)，置于濕盒中室溫孵育30 min。用洗滌緩沖液清洗切片5 min×3次。DAB顯色。將切片浸入ddH2O中洗滌，復(fù)染、脫水、封片。兩組各時(shí)間點(diǎn)每個(gè)樣本選取4個(gè)光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，計(jì)算Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)所占比例(陽性細(xì)胞率)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取70%肝切除術(shù)后6、24、36、48、120 h兩組樣本總RNA，并取1 μL于Nanodrop儀器上測(cè)量260/280 nm處的吸光度(A)值和RNA水平，通過TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。使用SYBR GREEN進(jìn)行PCR，獲得數(shù)據(jù)以相對(duì)定量(RQ)=2-ΔΔCT(CT為循環(huán)閾值)計(jì)算mRNA表達(dá)量，每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)每個(gè)引物添加3個(gè)復(fù)孔以縮小加樣誤差。引物序列：GAPDH正義鏈5’-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3’，反義鏈5’-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3’；EGFR正義鏈5’-ATG TCC TCA TTG CCC TCA AC-3’，反義鏈5’-GCA TGG GCA GTT CCC TAA G-3’。

1.6 Western印跡法檢測(cè)功能性Yap蛋白質(zhì)表達(dá) 采用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)組織裂解液加苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的混合液提取70%肝切除術(shù)后120 h兩組總蛋白質(zhì)，二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白質(zhì)水平。依照每孔50 μg蛋白質(zhì)用8%膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。70 V、90 min轉(zhuǎn)膜。置于5%牛血清白蛋白(BSA)4 ℃搖床過夜封閉。Yap(1∶1 000)、p-Yap(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗孵育，4 ℃搖床過夜。0.1%吐溫20 Tris緩沖液(TBST)洗膜，10 min×3次。二抗(1∶10 000)室溫孵育90 min。0.1%TBST洗膜，10 min×3次。顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Yap和p-Yap條帶灰度變化。

2 結(jié) 果

2.1 瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)肝切除術(shù)后小鼠肝體比的影響 瑞芬太尼組肝切除術(shù)后48和120 h的肝體比均顯著高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P值均<0.05)，兩組間肝切除術(shù)后6、24、36、192 h的肝體比的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，見表1。

2.2 瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)肝切除術(shù)后小鼠肝組織Ki-67表達(dá)的影響 兩組肝切除術(shù)后24、36、48、120、192 h肝臟標(biāo)本Ki-67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1。瑞芬太尼組肝切除術(shù)后36、48、120、192 h的Ki-67陽性細(xì)胞率均顯著高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P值分別<0.01、0.05)，兩組間肝切除術(shù)后24 h的Ki-67陽性細(xì)胞率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3 瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)肝切除術(shù)后小鼠肝組織EGFR表達(dá)的影響 瑞芬太尼組肝切除術(shù)后6 h的EGFR mRNA水平顯著高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，兩組間肝切除術(shù)后24、36、48、120 h的EGFR mRNA水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，見表1。

表1 兩組小鼠70%肝切除術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)肝體比、Ki-67陽性細(xì)胞率和EGFR mRNA水平比較

與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較：①P<0.05，②P<0.01

紅色箭頭所示為Ki-67陽性細(xì)胞 A 對(duì)照組術(shù)后24 h B 對(duì)照組術(shù)后36 h C 對(duì)照組術(shù)后48 h D 對(duì)照組術(shù)后120 h E 對(duì)照組術(shù)后192 h F 瑞芬太尼組術(shù)后24 h G 瑞芬太尼組術(shù)后36 h H 瑞芬太尼組術(shù)后48 h I 瑞芬太尼組術(shù)后120 h J 瑞芬太尼組術(shù)后192 h 圖1 70%肝切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)兩組Ki-67陽性細(xì)胞率比較(Ki-67免疫組織化學(xué)染色，×20)

2.4 瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)肝切除術(shù)后小鼠肝組織Yap和p-Yap蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 對(duì)照組和瑞芬太尼組肝切除術(shù)后120 h的肝組織Yap蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為1.039±0.117和0.978±0.099，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。瑞芬太尼組肝切除術(shù)后120 h的肝組織p-Yap蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為0.729±0.197，顯著低于對(duì)照組的0.944±0.077(P<0.05)。見圖2。

1～3 對(duì)照組 4～6 瑞芬太尼組 圖2 Western印跡法檢測(cè)70%肝切除術(shù)后120 h兩組Yap和p-Yap蛋白質(zhì)的表達(dá)

3 討 論

圍術(shù)期肝功能的保護(hù)和恢復(fù)是決定部分肝切除術(shù)后患者生存率的重要因素。諸多研究[7-9]已經(jīng)證實(shí)了瑞芬太尼對(duì)于多種臟器具有保護(hù)作用。本課題組的前期研究[5]結(jié)果表明，瑞芬太尼誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)可通過耗盡活性氧和抑制炎性反應(yīng)而減輕肝臟損傷。此外，外周和中樞的迷走神經(jīng)系統(tǒng)也參與了瑞芬太尼對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[10]。而在遭受外界一定程度的損傷之后，肝臟本身具有強(qiáng)大的再生能力，但目前尚無阿片類藥物與肝再生有關(guān)的確切研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明，瑞芬太尼預(yù)處理可促進(jìn)70%肝臟切除后的再生過程，不僅表現(xiàn)為促進(jìn)肝體比的增加和Ki-67陽性細(xì)胞率的升高，同時(shí)促進(jìn)了肝再生早期EGFR的表達(dá)和肝再生過程中功能性Yap表達(dá)的增加，該結(jié)果可能提供了新的角度來審視臨床瑞芬太尼的應(yīng)用對(duì)于患者預(yù)后的影響。

本研究所記錄的瑞芬太尼預(yù)處理時(shí)間為從腹腔內(nèi)注射瑞芬太尼開始至70%肝切除手術(shù)結(jié)束，受實(shí)驗(yàn)操作過程的影響，預(yù)處理時(shí)間有一定的波動(dòng)性，主要集中在20～30 min。為防止由瑞芬太尼預(yù)處理時(shí)間造成的差異偏倚，在本研究過程中對(duì)兩組預(yù)處理的時(shí)間進(jìn)行匹配。本研究中所采用的動(dòng)物模型是肝再生研究中的經(jīng)典模型，于1931年由Higgins等提出。既往研究[11]結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，70%肝切除后5～7 d，小鼠的肝臟就可以恢復(fù)到原始大小，因此本研究選擇肝切除術(shù)后192 h作為研究終點(diǎn)，以明確瑞芬太尼促進(jìn)肝再生的過程是促進(jìn)其生理狀態(tài)的肝再生，即只是加快了肝切除后肝再生的進(jìn)程，并不會(huì)影響肝再生的結(jié)局。Ki-67的免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果顯示，從肝切除術(shù)后36 h起剩余30%肝臟中增殖細(xì)胞的數(shù)量便顯著增多，且到術(shù)后192 h時(shí)這種細(xì)胞增殖的狀態(tài)依舊存在，這與肝再生后不同時(shí)間點(diǎn)肝體比的變化趨勢(shì)基本一致。

在肝再生的過程中，肝臟細(xì)胞的周期進(jìn)程受眾多有絲分裂相關(guān)生長(zhǎng)因子的影響，其中EGFR在肝再生中扮演著重要角色[12]，其配體作為肝細(xì)胞主要的促有絲分裂原，通過結(jié)合于相應(yīng)受體激活Ras-有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝細(xì)胞的再生[13]。已有研究[14]結(jié)果證明，EGFR是肝再生初期肝細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在肝再生早期，其表達(dá)量顯著增加[15]。在本研究中，肝切除術(shù)后6 h瑞芬太尼組EGFR mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，可能因在一定程度上促進(jìn)了早期的肝再生過程。

Hippo-Yap通路作為再生過程中的重要通路，參與多種器官再生修復(fù)的過程。而YAP的亞細(xì)胞定位受其磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)[16]，p-Yap保留在細(xì)胞質(zhì)中并不進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用，從而被降解。已有研究[17]結(jié)果表明，Yap的過表達(dá)可直接促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。對(duì)于肝臟而言，活化的功能性Yap在70%肝切除后顯著增加，且其活化和核定位在肝再生的早期增加，并隨著肝再生和肝體比逐漸接近術(shù)前水平而呈降低趨勢(shì)[18]。

本研究結(jié)果表明，瑞芬太尼預(yù)處理可顯著增加肝臟中活化的Yap的表達(dá)，與Ki-67免疫組織化學(xué)檢查的結(jié)果相互印證，從而明確了瑞芬太尼促進(jìn)肝再生的作用，提示瑞芬太尼預(yù)處理可能通過促進(jìn)Yap的功能性活化從而促進(jìn)70%肝切除后小鼠的肝再生。對(duì)于瑞芬太尼調(diào)節(jié)Yap活化的機(jī)制及其在促進(jìn)肝再生過程中的重要性，尚需聯(lián)系其上下游分子進(jìn)一步研究。就其臨床意義來說，瑞芬太尼可能會(huì)通過促進(jìn)肝再生過程，使肝切除患者更早地恢復(fù)正常的肝臟體積和功能，從而改善患者的生存預(yù)后，但該結(jié)論尚需進(jìn)一步的臨床研究支持。