基于ITS 2序列的15種淫羊藿屬藥用植物分類鑒定研究

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 貴陽 550025)

淫羊藿屬(EpimdiumL.)作為小檗科(Beiberdaceae)的一種多年生草本植物，有較高的藥用價值、觀賞價值及分類學(xué)研究意義[1]，其藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》?！吨腥A人民共和國藥典》1963版以來均有收載，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿屬含有黃酮類、酚苷類、多糖、色酮類等、淫羊藿次苷類、木脂素類、有機(jī)酸類、生物堿等各類化學(xué)成分約150個[4]，具有骨骼重塑、抗癌、抗衰老等功效[5]。不同種類、來源的淫羊藿藥材品質(zhì)差異大，研究淫羊藿屬內(nèi)的種間關(guān)系、進(jìn)行分類鑒定及屬內(nèi)種的“真實身份”，國內(nèi)外研究者做出了不懈努力[3]。但由于淫羊藿屬因其獨(dú)特的地理分布、雜交可育、種內(nèi)變異等特點(diǎn)，其種間界定仍模糊不清，被認(rèn)為是分類和系統(tǒng)發(fā)育上最具挑戰(zhàn)和困難的類群之一[6-14]。

ITS 2是核基因上位于5.85 rRNA基因區(qū)和大的亞單位編碼區(qū)之間的一個片段，其具有通用性好，變異性高，擴(kuò)增和測序料率高等優(yōu)點(diǎn)。在重樓屬、葫聲科、裸子植物、藻類、真菌和高等植物等藥用生物的鑒定中擴(kuò)增率和測序率均表現(xiàn)優(yōu)越，種水平和屬水平的鑒定成功率高，是鑒定物種屬及物種水平的研究熱點(diǎn)[15-17]。因此，進(jìn)一步應(yīng)用ITS 2序列，對淫羊藿屬進(jìn)行分類鑒定分析，為搞清淫羊藿屬內(nèi)種的“真實身份”提供參考，為該屬植物的種質(zhì)資源的保護(hù)與可持續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

本次研究共收集了淫羊藿屬15個種，共計46份實驗材料。實驗材料均采自原產(chǎn)地，由貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院何順志教授鑒定，活體材料保存于貴州同濟(jì)堂制藥有限公司淫羊藿資源圃(見表1)。并從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了淫羊藿屬ITS 2序列27條(詳見表2)。

2 方 法

2.1 淫羊藿植物總DNA提取與擴(kuò)增

取硅膠干燥淫羊藿植物葉片約40 mg，根據(jù)試劑盒(Tiangen Biotech Co．，China)說明書操作步驟提取樣品總DNA樣本。本實驗用于擴(kuò)增的引物(ITS 2)由大連寶生物科技公司設(shè)計合成(ITS 2 F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS 3 R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’)?？侱NA均采用50μL擴(kuò)增體系，引物正反序列各2μL、樣品總DNA 2μL、2×Taq PCR MasterMix 24μL、加ddH2O補(bǔ)足50μL。反應(yīng)體系為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s；72 ℃，10 min；10 ℃-over，40個循環(huán)。擴(kuò)增獲得單一明亮條帶的PCR產(chǎn)物樣品委托上海生工進(jìn)行雙向測序。

表1 供試材料來源

種名編號產(chǎn)地種名編號產(chǎn)地1.柔毛淫羊藿RM_11.四川眉州2.箭葉淫羊藿JY_11.安徽黃山(E. pubescens)RM_22.四川都江堰(E. sagittatum)JY_22.湖南吉首RM_33.四川成都JY_33.浙江龍泉RM_44.四川隆昌JY_44.貴州凱里RM_55.四川北川JY_55.貴州修文3.巫山淫羊藿WS_11.四川巴中4.粗毛淫羊藿CM_11.貴州開陽(E. wushanense)WS_22.貴州雷山(E. acuminatum)CM_22貴州雷山WS_33.貴州修文CM_33.重慶武隆WS_44.湖北巴東CM_44.貴州龍里WS_55.重慶巫溪——5.偏斜淫羊藿PX_11.湖南張家界6.單葉淫羊藿DY_11.貴州綏陽(E. truncatum)PX_22.湖南芷江(E. simplicifolium)DY_22.貴州鳳崗7.川鄂淫羊藿CE_11.重慶巫溪8.竹山淫羊藿ZS0011.湖北竹山(E. fargesii)CE_22.重慶巫山(E. zhushanense)ZS0022.湖北建始9.薄葉淫羊藿BY_11.四川茂縣10.保靖淫羊藿BJ_11.貴州萬山(E. membranaceum)BY_22.貴州貴陽(E. baojingense)BJ_22.湖南永順BY_33.貴州安順BJ_33.湖南城步11.湖南淫羊藿HN_11.廣西資源12.天平山淫羊藿TPS011.貴州臺江(E. hunanense)HN_22.湖南新寧(E. myrianthum)TPS022.貴州天柱HN_33.湖北鶴峰TPS033.貴州劍河13.淫羊藿Y(jié)Y_11.山西陵川14. 擬巫山淫羊藿BL_11.貴州雷山(E. revicornu)YY_22.山西陵川(E. pseudowushanense)BL_21.貴州雷山15.星花淫羊藿XH_11.湖北十堰BL_31.貴州雷山(E. stellulatum)XH_22.甘肅成縣——

2.2 數(shù)據(jù)處理方法

測序所得峰圖應(yīng)用CodonCode Aligner V 2.06(CodonCode Co.，USA)軟件進(jìn)行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量序列。所得各序列經(jīng)ClustalXV 2.0 (Higgins D.G)軟件進(jìn)行多序列比對并查錯，再應(yīng)用The ITS 2 Database在線工具(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)進(jìn)行注釋剪切，去除序列兩端質(zhì)量較差的堿基，剪切得到的序列在NCBI

表4 基于ITS 2序列變異的15種淫羊藿屬植物K 2 P遺傳距離中進(jìn)行BLAST，提取同源性較高的ITS 2序列。應(yīng)用Geneious 10.0軟件分析ITS 2的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，應(yīng)用The ITS 2 Database中Predict功能進(jìn)行ITS 2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用MEGA 7.0軟件計算(Kimura-2-parameter，K 2 P)距離值，比較ITS 2序列的種間、種內(nèi)變異值；最后采用相似性搜索算法(BLAST 1)和最近距離法(Nearest Distance)考察ITS 2序列的鑒定成功率，應(yīng)用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

編號BJBLBYCECMDYHNJYPXRMTPSWSXHYYZSBJBL0.0084BY0.01260.0042CE0.00420.00420.0083CM0.01260.00420.00830.0084DY0.00840.00000.00420.00420.0042HN0.00840.00000.00420.00420.00420.0000JY0.00840.00210.00420.00420.00420.00000.0000PX0.00000.00840.01260.00420.01260.00840.00840.0111RM0.00840.00000.00420.00420.00420.00000.00000～0.00420.0084TPS0.00840.00000.00420.00420.00420.00000.00000～0.00420.00840.0000WS0.00840.00000.00840.00420.00840.00000.00420.00840.00420～0.00410～0.00830.0042XH0.01260.00420.00830.00840.00840.00420.00420.0042～0.00840.01260.00420.00420.0063YY0.00840.00000.00420.00420.00420.00000.00000～0.00420.00840.00000.00000.00830.0042ZS0.00420.00420.00830.00000.00840.00420.00420.0042～0.00840.00420.00420.00420.00420.00840.0042DV2.61822.47442.49942.47442.61822.47442.47442.47442.61822.47442.47442.47442.61822.47442.4744

注：編號與表2相對應(yīng)。

表2 淫羊藿屬植物ITS 2序列NCBI查詢情況

序號中文名 學(xué)名 GB編號ZS竹山淫羊藿 E. zhushanenseJN010312PX偏斜淫羊藿 E. truncatumJN010310WS巫山淫羊藿E. wushanenseAY362421,JF421495,JN010311CM粗毛淫羊藿E. acuminatumAY362423,FJ980426,FJ980427,JN010262BJ保靖淫羊藿E. baojingenseJN010264YY淫羊藿E. brevicornu AY362429,JN010267,KC733405CE川鄂淫羊藿E. fargesiiJN010279BY薄葉淫羊藿E. membranaceumJN010289BL擬巫山淫羊藿E. pseudowushanenseJN010298TPS天平山淫羊藿E. myrianthumJN010291 HN湖南淫羊藿E. hunanenseJN010283RM柔毛淫羊藿E. pubescens AY362416,JN010299JY箭葉淫羊藿E. sagittatumAY362427,FJ980429,JN010304DY單葉淫羊藿E. simplicifoliumAY362420,JN010307,KC494651XH星花淫羊藿E. stellulatumJN010308 DV八角蓮Dysosma versipellisKY701310.1

3 結(jié)果與分析

3.1 淫羊藿屬ITS 2序列特征分析

所有樣品擴(kuò)增成功率與測序成功率均為100%，表明ITS 2序列在15種淫羊藿屬植物中的通用性好。應(yīng)用Geneious 10.0軟件進(jìn)行序列分析，15種淫羊藿屬ITS 2長度均為247 bp，GC含量為55.1%。本實驗獲得46條ITS 2序列，從GeneBank中獲得27條，共計73條ITS 2序列，共存在75個堿基變異位點(diǎn)，其中箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、單葉淫羊藿變異位點(diǎn)數(shù)量較多，位居前三，其余種類僅有1～3個變異位點(diǎn)。

3.2 淫羊藿屬ITS 2序列種內(nèi)和種間變異分析

應(yīng)用MEGA 7.0軟件通過K 2 P模型，統(tǒng)計淫羊藿屬種間和種內(nèi)遺傳分化情況，獲得的ITS 2序列的種內(nèi)變異，最大種內(nèi)變異，種內(nèi)變異平均值，種間變異，最小種間變異，種間變異平均值值詳情見表4。由表4可見，ITS 2的在淫羊藿屬中的種間變異較小，ITS 2序列鑒定成功率約為60%。采用比對法(Blast)分析，ITS 2鑒定效率為75%。除箭葉淫羊藿存在2個種內(nèi)遺傳變異(0.004 2)、巫山淫羊藿存在2個種內(nèi)遺傳變異(0.008 3)外，其余種類種內(nèi)遺傳距離均為0。總體看，淫羊藿屬與外類群(鬼臼屬)遺傳距離較遠(yuǎn)，易于區(qū)分。但屬內(nèi)種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離存在交叉情況，較為復(fù)雜，難以在分開。15種淫羊藿屬植物ITS 2序列居于K 2 P下的種內(nèi)與種間變異計算情況詳見表5。

表3 ITS 2序列的種內(nèi)和種間遺傳距離

遺傳距離 ITS2Avg intra avg0.0050±0.0031Avg intra max0.0058±0.0039Avg intra between intra-species0.0056±0.0044Avg interby G 0.0066±0.0012Avg inter by G min0.0007±0.0011Avg between inter by Genus0.0067±0.0037

注：Bootstrap 1 000次重復(fù)，支持?jǐn)?shù)值僅顯示自展支持率≥50%。

圖1 基于ITS 2構(gòu)建的15種淫羊藿屬藥用植物ML系統(tǒng)進(jìn)化樹

3.3 淫羊藿屬ITS 2序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

本實驗通過測序獲得ITS 2序列46條，從GeneBank查詢獲得27條，以及外類群八角蓮ITS 2序列，總共73條ITS 2序列，應(yīng)用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)，自展支持率(bootstrap)1 000次重復(fù)檢驗進(jìn)行ML系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(見圖2)。由ITS 2系統(tǒng)進(jìn)化樹可知：淫羊藿屬與鬼臼屬八角蓮各為一支，易于分開。本次研究的樣品中，除薄葉淫羊藿、竹山淫羊藿、巫山淫羊藿外，其余均種類均能較好的進(jìn)行聚類；巫山淫羊藿WS 1、WS 2、WS 3 聚為一支，WS 4、WS 5聚為一支；竹山淫羊藿的2個樣品相差甚遠(yuǎn)，不能聚集。NCBI下載的ITS 2序列除單葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿外，其余種類能較好的聚類。但本次測序獲得的ITS 2序列除粗毛淫羊藿、保靖淫羊藿外其余均不能與NCBI下載到的序列進(jìn)行聚類。

3.4 淫羊藿屬ITS 2序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

淫羊藿屬ITS 2二級結(jié)構(gòu)由1個中心環(huán)和4個螺旋區(qū)構(gòu)成，第1螺旋區(qū)有3個莖節(jié)環(huán)，第2螺旋區(qū)有4個莖節(jié)環(huán)，第3螺旋區(qū)有2個莖節(jié)環(huán)，第4螺旋區(qū)有3個莖節(jié)環(huán)。15個淫羊藿屬植物二級結(jié)構(gòu)構(gòu)型極為相似，長度均較相同，僅在臂環(huán)大小、開口位置、大小上具有一定區(qū)別。因此，從二級結(jié)構(gòu)上難以將淫羊藿屬種間進(jìn)行分類鑒別。15種淫羊藿屬植物ITS 2序列二級結(jié)構(gòu)詳見圖2。

4 討 論

淫羊藿屬藥用植物種類繁多，分布廣泛，種的分布區(qū)域性強(qiáng)，給其準(zhǔn)確鑒定帶來了較大難度。作為歷版《中國藥典》和各個地方中藥材和民族藥地方標(biāo)準(zhǔn)來源最多的藥物種類之一，不同藥材來源種類和產(chǎn)地的化學(xué)成分構(gòu)成比例差異較大，使得該藥材的質(zhì)量難以控制，最終導(dǎo)致臨床藥效不穩(wěn)定。DNA條形碼是以染色體組為基礎(chǔ)，利用相對較短的DNA片段，構(gòu)建核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，對待測樣品進(jìn)行序列數(shù)據(jù)比對，實現(xiàn)生物身份識別的方法。采用這種快速、有效、準(zhǔn)確的方法對我國淫羊藿屬藥用植物進(jìn)行鑒定，可解決物種基原混亂等問題，為合理開發(fā)利用我國淫羊藿屬藥用植物資源提供理論依據(jù)。

本研究對淫羊藿屬藥用植物的15個種46份材料進(jìn)行了ITS 2序列條形碼進(jìn)行研究，結(jié)果表明，ITS 2引物通用性好，擴(kuò)增成功率和測序成功率均為100%；序列長度均為247 bp。通過K 2 P模型評估序列鑒定效率，ITS 2序列鑒定成功率僅為60%，采用比對法(Blast)分析，ITS 2的種間鑒定效率為75%。從Barcoding Gap圖可知，ITS 2序列有利于對淫羊藿屬部分物種鑒定。從ML樹圖中鑒別能力分析結(jié)果得出，ITS 2序列ML系統(tǒng)進(jìn)化樹具有較好的鑒別能力，但部分種內(nèi)與種間變異復(fù)雜，存在鑒定錯誤現(xiàn)象，這可能是序列錯誤或者種類雜交所致。淫羊藿屬各樣本種內(nèi)與種間遺傳較為混亂，變異遺傳距離復(fù)雜，但I(xiàn)TS 2二級結(jié)構(gòu)形態(tài)亦極為相似?？梢?，該序列的在遺傳中的變異度較小，較為保守，但種內(nèi)變異方向較為復(fù)雜，用其將各種間進(jìn)行區(qū)分有一定難度，不適合單獨(dú)作為該屬條形碼使用。本研究豐富了淫羊藿屬植物研究數(shù)據(jù)，為其資源開發(fā)利用及系統(tǒng)關(guān)系的研究提供一定參考。但本研究收集的種類不夠全面，部分種類居群來源較少，對該屬的分子鑒定還需從大樣本、多序列組合，結(jié)合地理格局、細(xì)胞器基因組等進(jìn)一步討論其種內(nèi)與種間關(guān)系、物種形成、譜系、演化等問題。

注：圖中1，2，3，4分別表示二級結(jié)構(gòu)的第一螺旋區(qū)，第二螺旋區(qū)，第三螺旋區(qū)和第四螺旋區(qū)。

圖2 淫羊藿屬15個種ITS 2序列二級結(jié)構(gòu)(編號與表2相對應(yīng))