HPLC同時(shí)測(cè)定炙黃芪配方顆粒特征圖譜及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量△

姚娜，黃燕明，李雪銀，陳桂生

1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤(pán)山中藥資源開(kāi)發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300

炙黃芪配方顆粒是以炙黃芪飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒、包裝等工藝制備而成。原料炙黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根炮制加工品。其具有益氣補(bǔ)中，臨床上用于氣虛乏力，食少便溏[1]。黃芪中的主要化學(xué)成分研究及相關(guān)的藥理作用已有報(bào)道[2-4]，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷是主要的有效成分之一。黃芪經(jīng)炮制后，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量有明顯變化[5-7]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于HPLC同步測(cè)定炙黃芪配方顆粒特征圖譜和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)家也尚未出臺(tái)該中藥配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了有效控制和評(píng)價(jià)炙黃芪配方顆粒的質(zhì)量，本研究采用HPLC建立了同步測(cè)定炙黃芪配方顆粒的特征圖譜并對(duì)指標(biāo)成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行定量檢測(cè)的方法[8]。

1 材料

1.1 儀器

十萬(wàn)分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國(guó)密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀；Agilent 1200高效液相色譜儀。

1.2 試藥

蒙古黃芪對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120974-201311，規(guī)格：1 g/瓶)；膜莢黃芪對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121462-201304，規(guī)格3 g/瓶)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111920-201505，純度：97.1%)；乙腈、甲酸均為色譜級(jí)；甲醇為分析純。

炙黃芪配方顆粒10批來(lái)自廣州市香雪制藥股份有限公司，批號(hào)依次為S1～S10；麥芽糊精來(lái)自湖州展望藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫方式0～40 min，10%～50%A，90%～50%B；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取炙黃芪配方顆粒約1 g，研細(xì)，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖。

2.5 10批樣品的檢測(cè)結(jié)果

分別取10批炙黃芪配方顆粒，按2.3項(xiàng)下方法制備10份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，得到10批炙黃芪配方顆粒的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.317 2、0.309 1、0.317 3、0.311 2、0.318 5、0.313 3、0.678 8、0.691 3、0.683 4、0.687 8 mg·g-1，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.462 8 mg·g-1；得到10批炙黃芪配方顆粒的色譜疊加圖，見(jiàn)圖1，通過(guò)對(duì)10批的色譜圖進(jìn)行分析，有4個(gè)色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故確立了4個(gè)特征峰，其中1號(hào)峰的保留時(shí)間及紫外光譜與毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品吻合，故供試品特征圖譜中1號(hào)峰鑒定為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，相對(duì)保留時(shí)間的規(guī)定值為：1.00(峰1)、1.46(峰2)、1.75(峰3)、2.38(峰4)。

2.6 特征圖譜方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 取炙黃芪配方顆粒、麥芽糊精、蒙古黃芪對(duì)照藥材及膜莢黃芪對(duì)照藥材分別按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，4個(gè)共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專屬性。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取同一批炙黃芪配方顆粒供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以1號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰為參照，對(duì)各圖譜的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0%～0.07%，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，表明儀器精密度良好。

注：S1.201503001批次；S2.201503002批次；S3.201503003批次；S4.201503004批次；S5.201503005批次；S6.201503006批次；S7.201503007批次；S8.201503008批次；S9.201503009批次；S10.201503010批次。圖1 10批炙黃芪配方顆粒HPLC特征圖譜疊加圖

注：S1.空白溶劑；S2.陰性對(duì)照；S3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品；S4.蒙古黃芪對(duì)照藥材；S5.膜莢黃芪對(duì)照藥材；S6.炙黃芪配方顆粒。圖2 炙黃芪配方顆粒特征圖譜專屬性試驗(yàn)

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批炙黃芪配方顆粒樣品，平行6份，按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以1號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰為參照，對(duì)各圖譜的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0%～0.07%，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批炙黃芪配方顆粒供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以1號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰為參照，對(duì)各圖譜的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果各圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0%～0.07%，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 中間精密度試驗(yàn) 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設(shè)備對(duì)精密度的影響，結(jié)果不同影響因素下各圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RAD值在0%～0.63%，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，表明該方法精密度良好，隨機(jī)變動(dòng)因素不影響該方法精密度。

2.6.6 耐用性試驗(yàn) 取同一批炙黃芪配方顆粒供試品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種型號(hào)的色譜柱，測(cè)定炙黃芪配方顆粒的特征圖譜，記錄色譜圖。

以1號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰為參照，各圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值小于2.84%，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，表明該方法耐用性良好。

2.7 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系及范圍 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度：49.33 μg·mL-1)，采用自動(dòng)進(jìn)樣器分別進(jìn)樣0.1、0.5、1、2、5、10、15、20 μL，在260 nm下測(cè)定，即毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量為0.004 9、0.024 7、0.098 7、0.246 6、0.493 3、0.740 0、0.986 6 μg，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積積分值對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品的進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：Y=37.68X-0.016，相關(guān)系數(shù)r=1；結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.004 9～0.986 6 μg，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 同2.6.3項(xiàng)下進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，RSD為2.88%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同2.6.4項(xiàng)下測(cè)定，對(duì)照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.41%、1.05%，表明炙黃芪配方顆粒供試品溶液及毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的炙黃芪配方顆粒適量，平行9份，分別精密加入低、中、高濃度的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品，按供試品項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，平均回收率為96.26%，RSD為2.80%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.7.5 中間精密度試驗(yàn) 同2.6.5項(xiàng)下測(cè)定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RAD在0.11%～0.59%，表明該方法中間精密度良好。

2.7.6 耐用性試驗(yàn) 同2.6.6項(xiàng)下測(cè)定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD為0.56%，表明該方法耐用性良好。

3 討論

特征圖譜方法研究中，參考文獻(xiàn)[9]，進(jìn)行流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn)，炙黃芪配方顆粒主要色譜峰集中在乙腈-0.2%甲酸溶液10∶90～50∶50，且毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰出峰時(shí)間過(guò)早，故優(yōu)化流動(dòng)相比例。

在毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定中，對(duì)其定量下限進(jìn)行研究。取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度：49.33 μg·mL-1)適量，進(jìn)樣0.1 μL，依法測(cè)定。信噪比約為20∶1時(shí)，對(duì)應(yīng)毛蕊異黃酮葡萄糖苷的量為0.004 9 μg，即本含量測(cè)定方法的定量限0.004 9 μg。

對(duì)蒙古黃芪和膜莢黃芪的特征圖譜進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪與膜莢黃芪中均含4個(gè)特征峰，未見(jiàn)明顯區(qū)別。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)中建立的采用HPLC同步檢測(cè)炙黃芪配方顆粒毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量與特征圖譜方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好，為炙黃芪配方顆粒質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了參考。