管花肉蓯蓉提取物正丁醇殘留量檢測及去除工藝優(yōu)選△

霍仕霞，張雨欣，毛樂靜，閆明

新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830094

管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)R.Wight為列當科植物，具有壯陽補腎、益精血、潤腸通便等功效[1]。主要分布于新疆南疆的塔克拉瑪干沙漠及其周圍地區(qū)，是新疆特色植物資源，主產(chǎn)于塔里木盆地，資源較豐富，栽培技術(shù)成熟[2]。目前已收載于《中華人民共和國藥典》。目前從管花肉蓯蓉中分離得到的化合物主要有苯乙醇苷類、木脂素類、環(huán)烯醚萜苷類化合物等。現(xiàn)代藥理研究表明，管花肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物具有補益[3]、抗氧化、保肝和神經(jīng)保護作用[4-5]。朱乃亮等[6]研究表明，管花肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分含量明顯高于其他肉蓯蓉，且苯乙醇苷類成分含量明顯高于環(huán)烯醚萜苷類成分。王毓杰[7]采用大孔樹脂從管花肉蓯蓉中制備出苯乙醇苷化合物，篩選出穩(wěn)定可行的純化工藝。李承花等[8]采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同時測定了管花肉蓯蓉中4種苯乙醇苷的含量。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，管花肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分在神經(jīng)保護和抗神經(jīng)退行性疾病方面，尤其是在抗老年癡呆方面具有良好的應用前景，已成為人們研究的熱點。課題組前期通過體內(nèi)外藥效篩選表明，管花肉蓯蓉中的苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷對岡田酸誘導的Alzheimer病細胞模型具有保護作用、對東莨菪堿誘導的小鼠記憶功能障礙模型具有拮抗作用、對D-半乳糖制備衰老模型具有拮抗作用，并從整體動物、細胞以及分子生物學水平開展了毛蕊花糖苷抗AD作用機制的研究。目前已對其制備工藝進行系統(tǒng)研究，其中正丁醇萃取管花肉蓯蓉，從而獲得純度較高的中間品是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，正丁醇萃取后，減壓濃縮得到含量較高的含毛蕊花糖苷萃取物。然而，《中華人民共和國藥典》中將正丁醇列為第三類溶劑，雖然毒性低，但是正丁醇大量殘留會對皮膚和呼吸系統(tǒng)造成刺激，還會引起全身不適。因此，為控制最終產(chǎn)品的質(zhì)量，保障藥物的用藥安全，完善管花肉蓯蓉有效成分毛蕊花糖苷的富集工藝，使其萃取物中正丁醇的殘留量不超過《中華人民共和國藥典》規(guī)定的限度。

1 材料

1.1 儀器

GC-2010高效氣相色譜儀(日本島津公司)；BS224S電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；S2840HP超聲波清洗器(上海亞榮科導超聲儀器有限公司)；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精密試驗設(shè)備有限公司)；N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHZ-24水浴恒溫振蕩器(上海梅香儀器有限公司)。

1.2 試藥

管花肉蓯蓉購自新疆麥迪森維藥有限公司(批號：20161211)；管花肉蓯蓉提取物由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑研究室制備(管花肉蓯蓉經(jīng)65%乙醇提取后，提取液減壓濃縮、干燥制備得到干浸膏，批號：20170603，干浸膏水溶解混懸后，正丁醇萃取，收集正丁醇層，濃縮干燥即得)；正丁醇、甲醇(天津市富宇精細化工有限公司，色譜純)；其他試劑為分析純；去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正丁醇去除工藝

本工藝采用共沸法對管花肉蓯蓉提取物中殘留的正丁醇進行去除，即在管花肉蓯蓉提取物中加入水為夾帶劑，與正丁醇形成水-正丁醇共沸物，降低沸點，從而使管花肉蓯蓉提取物中殘留正丁醇能夠被帶出[9]，使藥液中正丁醇盡量去除。

2.2 因素與水平

選取旋蒸溫度(A)、加水量(B)(以管花肉蓯蓉提取物的體積倍數(shù)計)及加水次數(shù)(C)作為本試驗考察因素，以去除后的殘留正丁醇殘的量為考察指標，采取正交試驗設(shè)計，優(yōu)選得到最佳的去除殘留正丁醇的工藝。

2.3 正交試驗方法

根據(jù)正交設(shè)計試驗中因素及水平，將100 mL管花肉蓯蓉提取物減壓蒸出正丁醇-水混合液，觀察少有或沒有溶劑蒸出時，視為正丁醇去除效果能夠滿足要求，用甲醇將所得的濃縮物溶解至100 mL容量瓶中并定容，測定其中正丁醇的含量。

2.4 正丁醇殘留量測定

2.4.1 色譜條件 Agilent DB-WAX色譜柱(30 m×0.32 mm，0.5 μm)，F(xiàn)ID檢測器；進樣口溫度：220 ℃；檢測口溫度：240 ℃；恒溫程序：溫度35 ℃，保持15 min，進樣量1 μL，進樣方式為不分流進樣。

2.4.2 對照品溶液的制備 取50 mg正丁醇溶液，精密稱定，置于100 mL量瓶中，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取所制溶液約1.0 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.4.2項下配置的正丁醇對照品溶液適量，分置于10 mL量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、150 μg·mL-1的待測樣，甲醇定容，搖勻，依次精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀，以峰面積為縱坐標，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，進行線性回歸，得線性方程Y=13 609X+13 095(r=0.999 5)，表明正丁醇在0.05～150 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液按照2.4.1項下色譜條件進行分析，連續(xù)進樣6次，得正丁醇峰面積的RSD為1.74%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取正交試驗1號樣品母液，依據(jù)2.4.1項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣檢測，計算RSD為1.48%，表明其在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復性試驗 精密稱取正交試驗1號樣品母液6份各1.0 g，依據(jù)2.4.1項下色譜條件進樣，計算RSD為1.51%，表明方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 精密吸取9份正交試驗1號樣品母液約0.5 g，精密稱定，精密加入100 μg·mL-1的對照品溶液2.25 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按照2.4.1項下色譜方法進樣測定，得平均回收率為100.5%，RSD為1.83%，表明方法準確、可靠。

2.4.9 最低檢出限及定量限 采用逐步稀釋法進行測定，以信噪比約為3∶1時計算最低檢出限，以信噪比約為10∶1時計算定量限，結(jié)果正丁醇的最低檢出限為25 ng·mL-1，定量限為40 ng·mL-1。

2.4.10 正交試驗樣品測定 依次在2.4.1色譜條件下重復2次測定正交試驗制備得到的樣品，以峰面積和2.4.4中的線性方程計算出供試品濃度，由公式(1)可計算出正交試驗樣品中的正丁醇含量，并得到最佳的管花肉蓯蓉提取物殘留正丁醇去除工藝。

(1)

由方差分析結(jié)果可知，旋蒸溫度、加水量和旋蒸次數(shù)均顯著影響管花肉蓯蓉提取物中殘留正丁醇的去除。直觀分析結(jié)果表明，各因素對管花肉蓯蓉提取物中正丁醇殘留量影響順序為C>A>B。因此，確定去除管花肉蓯蓉提取物中殘留正丁醇的最佳工藝為A2B3C3，即80 ℃減壓濃縮3次，每次加水量為0.8倍，見表1～2。

2.4.11 最佳工藝驗證實驗 取管花肉蓯蓉提取物3份，按最佳工藝操作，正丁醇質(zhì)量分數(shù)分別為0.000 5%、0.000 5%、0.000 9%，平均值約0.000 6%。

表1 正交試驗中正丁醇殘留量測定

表2 方差分析結(jié)果

3 討論

3.1 正丁醇去除方法的選擇

目前藥物制劑中殘留有機溶劑的去除工藝常用的有生物膜萃取法、共沸法以及超臨界二氧化碳萃取法等[10-12]。其中共沸法是通過加入蒸餾水，在加熱的條件下，蒸餾水與提取物中殘留的正丁醇形成水-正丁醇共沸物，新形成的共沸物的揮發(fā)性明顯比水和正丁醇的揮發(fā)性好，因新的共沸物與原來的溶液中的各組分完全不同，它的揮發(fā)不影響原溶液的質(zhì)量；同時共沸法對設(shè)備要求不高，簡單的蒸餾裝置即可完成，操作簡便、效率高，對共沸試劑的質(zhì)量要求也不高，可同時分離多組分化合物，達到去除有機試劑的目的，尤其是對難分離、沸點相近的物質(zhì)，也能夠?qū)崿F(xiàn)很好的分離，可操作性強[13]。共沸法作為有效的分離手段主要應用在醇類脫水、稀酸回收、酯類生產(chǎn)等實際生產(chǎn)過程中。目前已有研究報道采用共沸法去除天舒滴丸、六味生物制劑制備過程中殘留的正丁醇溶劑[14-15]。管花肉蓯蓉有效成分的提取過程中用到了大量的水飽和正丁醇，因此，本研究采用共沸法去除管花肉蓯蓉提取物中殘留正丁醇并進行工藝優(yōu)化，以最大限度的去除殘留正丁醇，達到《中華人民共和國藥典》要求標準。

3.2 色譜條件的選擇

本研究對氣相色譜條件進行了考察，在選擇氣相色譜柱時，首要考慮的是固定相在待分析供試品和固定相功能團之間有不同的相互作用關(guān)系，因此應該盡量多了解色譜柱和待分析的供試品的特點。色譜柱的選擇應按照“相似相溶”的基本原理，如被分離的供試品中既有極性物質(zhì)，又有非極性物質(zhì)，則沸點相近的極性物質(zhì)先被分離出來；被分離的供試品如水、醇等，能夠形成氫鍵，供試品中各組分與色譜柱之間主要是氫鍵作用力，各組分則按照與色譜柱形成的氫鍵能力的大小而被先后分離出來，這種供試品則可以選擇氫鍵型色譜柱。如被分離的供試品是極性物質(zhì)，一般選擇極性色譜柱，極性小的先被分離。正丁醇為極性大的有機溶劑，因此本研究中選用極性色譜柱。另外，柱溫對分離效能和分析速度影響也很大，是氣相色譜法檢測中很關(guān)鍵的參數(shù)。提高色譜柱的柱溫可縮短分析時間，保留時間提前；降低色譜柱的柱溫，則色譜柱對分離的化合物柱選擇性更大，有利于提高供試品中各組分的分離度，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性也得到了提高，延長色譜柱的使用壽命。一般采用色譜柱的柱溫考慮等于或高于待測物的平均沸點10 ℃左右。本研究中通過改變柱溫，以調(diào)節(jié)正丁醇色譜峰的保留時間、峰形和分離度，最終采用恒溫程序35 ℃。

進樣方式選擇上，一般分流進樣適合于可揮發(fā)性的供試品，不分流進樣的靈敏度明顯高于分流進樣，但由于氣相色譜進樣口的溫度、色譜柱的初始溫度等參數(shù)都與溶劑的沸點有直接的關(guān)系，不分流進樣對供試品溶劑要求較為嚴格，一般溶劑色譜峰的峰較大，易覆蓋供試品色譜峰，只有溶劑的極性與供試品的極性相匹配，才能保證溶劑在被測供試品出峰之前就出峰，而選擇高沸點溶劑比低沸點溶劑更有利于分析供試品，本研究中的測定對象，正丁醇的沸點是117.7 ℃，沸點較高，采用不分流進樣方式，適當改變初始溫度，實現(xiàn)固定相聚焦，有利于獲得可靠、可信的分析結(jié)果，還能夠縮短分析時間，因此本研究中選擇不分流進樣方式。

4 結(jié)論與展望

實驗結(jié)果表明，各因素對管花肉蓯蓉提取物中正丁醇殘留量影響順序為C>A>B，提取物經(jīng)優(yōu)選的最佳去除工藝為A2B3C3，即80 ℃減壓濃縮3次，每次加水量為0.8倍，經(jīng)處理后，驗證實驗結(jié)果測得殘留正丁醇平均質(zhì)量分數(shù)為0.006 6‰，遠低于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的限度。因此，本研究所優(yōu)選的管花肉蓯蓉提取物中萃取后殘留有機溶劑去除工藝及正丁醇殘留量檢測方法可應用于生產(chǎn)的內(nèi)控質(zhì)量標準，具有成本較低，操作簡便，安全等特點，實際應用價值較大。中藥所含成分復雜，在滿足其中的有效成分能都夠提取的同時保證有機試劑的殘留量低于《中華人民共和國藥典》限度，從而保證藥物使用的安全性。目前有機溶劑萃取法被越來越多地應用于中藥中化合物提取與分離，而殘留溶劑的去除與殘留量檢測是當前新藥研發(fā)及其質(zhì)量控制中必須要解決的問題，也是提高中藥有效成分提取物質(zhì)量標準的關(guān)鍵。本實驗優(yōu)選的去除管花肉蓯蓉有效部位提取物中正丁醇的方法，也為其他同類工藝研究提供參考。