牡丹皮藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量評價△

鄧愛平，方文韜，，謝冬梅，張悅，3，方成武，康傳志，呂朝耕，岳媛，康利平，南鐵貴，趙玉洋，郭蘭萍，詹志來

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；4.重慶市中藥研究院，重慶 400065

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，用藥歷史悠久，具有很高的藥用價值。其味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，有清熱涼血、活血化瘀之功效[1]。現(xiàn)代研究表明其具有苷類、鞣質(zhì)類、多糖類等多種化學(xué)成分[2-7]。作為常用大宗藥材，其產(chǎn)地較多且市場交易量大，商品規(guī)格等級也較多。由于受多種因素的影響，原有《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》(1984年頒布實施)中牡丹皮商品規(guī)格等級劃分與現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)對牡丹皮藥材性狀規(guī)定以及當(dāng)前市場等級劃分現(xiàn)狀存在較大的出入[8]，如：《中國藥典》在連丹皮性狀項下做出“長5～20 cm，直徑0.5～1.2 cm”的限定，而《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》中“鳳丹”和“連丹”一等品項下限定為“長6 cm以上，中部圍粗2.5 cm以上”；又如牡丹皮傳統(tǒng)大多按照產(chǎn)地、長度、直徑進行商品規(guī)格等級的劃分，目前市場多以抽心率的高低作為等級劃分依據(jù)，而木心為非藥用部位，不少等級的牡丹皮藥材超出了《中國藥典》非藥用部位限量的要求，屬于不合格品。因此，這種劃分方法顯然影響著藥材質(zhì)量。另外，各產(chǎn)地、各藥材市場等級劃分較為隨意，同一藥材市場的不同商戶之間規(guī)格等級劃分也極不統(tǒng)一。因此，亟待制訂適應(yīng)新時期市場需求的牡丹皮商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)，以規(guī)范牡丹皮藥材市場交易，引導(dǎo)市場優(yōu)質(zhì)優(yōu)價，形成良性循環(huán)。

目前關(guān)于中藥材商品規(guī)格等級及質(zhì)量評價研究主要基于感官評價、化學(xué)評價及生物活性評價或這幾種方法相結(jié)合的評價方法，以化學(xué)質(zhì)量評價為主，而其中又以指標(biāo)性成分的含量作為評價依據(jù)，然而指標(biāo)性成分與有效成分之間的關(guān)聯(lián)性不明確，且受其在植物的不同分布情況影響，難以客觀反映藥材質(zhì)量。近年來，基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法在中藥材質(zhì)量評價方面的優(yōu)勢日益突出，其一方面彌補了紫外檢測器對不含不飽和鍵的化合物響應(yīng)差的短處，另一方面，其較為靈敏，因此逐步得到廣泛應(yīng)用。牡丹皮商品質(zhì)量研究已開展不少相關(guān)工作[9-13]，多集中在不同產(chǎn)地、不同直徑藥材的幾個主要的指標(biāo)性成分(如丹皮酚、芍藥苷)的含量比較上，而對于其他成分(如多糖)含量以及不同部位化學(xué)成分差異的系統(tǒng)性綜合比較分析仍然值得進一步深入的研究?，F(xiàn)代研究表明，丹皮多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、降血脂等多種藥理作用[14-16]，且根莖類藥材多糖等大分子成分所占比例較小分子成分高，也有必要開展相關(guān)比較研究。

基于此，本文在商品調(diào)查基礎(chǔ)上，進行性狀數(shù)據(jù)測量，總結(jié)當(dāng)前劃分的性狀數(shù)據(jù)規(guī)律，并將傳統(tǒng)性狀劃分與質(zhì)量評價相結(jié)合，以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為主要手段，對牡丹皮中化學(xué)成分進行系統(tǒng)表征，并結(jié)合PCA及OPLS-DA數(shù)據(jù)分析方法，對當(dāng)前牡丹皮藥材商品規(guī)格等級劃分的主要因素(如產(chǎn)地、加工、部位、粗細等)開展了深入的定性與定量比較分析評價，以期闡明牡丹皮外觀性狀與內(nèi)在質(zhì)量的規(guī)律，為科學(xué)制訂牡丹皮商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器及試劑

1.1 儀器

ACQUITY I-Class超高效液相色譜儀；Waters Xevo-G2-S Q-TOF MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Waters公司)ACQUITY UPLCTM I-Class-QTRAP 6500四極桿-線性子阱質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX公司，配有離子噴霧接口)；Waters ACQUITY UPLC-T3-C18S色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；BSA224S型萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；Centrifuge 5415D型離心機(德國Eppendorf公司)；SB-800-DTD型超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Pacific T-Ⅱ型超純水儀(美國Thermo公司)；Agilent 1260 HPLC(美國安捷倫科技有限公司)；WFJ型可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.2 試劑

對照品有芍藥苷(P)、氧化芍藥苷(OP)、苯甲酰芍藥苷(BP)、苯甲酰氧化芍藥苷(BOP)、沒食子酸甲酯(GM)、沒食子酸(GA)、五沒食子酰葡萄糖苷(PentaG)、丹皮酚新苷(PX)、丹皮酚原苷(PY)、丹皮酚(Paeonol)(純度均≥98%，融誠鑫徳科技發(fā)展有限公司)；D-葡萄糖(99.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號為110833-201506)；蒽酮(分析純，含量>98%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為20160315)；硫酸(分析純，含量95%～98%，北京化工廠，批號為20160516)。水為超純水、甲醇，乙腈為色譜純(美國Fisher Scientific公司)，其余試劑均為分析純。

2 實驗內(nèi)容

2.1 商品調(diào)查

2016年4月至2017年11月，課題組成員先后實地走訪了安徽亳州、銅陵及重慶墊江幾個牡丹皮主產(chǎn)區(qū)，到田間地頭實地查看牡丹皮的田間管理和采收情況，同時到多戶藥材收購商(家庭小作坊式)存放牡丹皮藥材的庫房查看牡丹皮的初加工、儲藏和規(guī)格等級劃分情況，并先后赴安徽亳州、河北安國、四川荷花池及廣西玉林等各大藥材市場，對牡丹皮藥材進行市場流通情況調(diào)查。

2.2 外觀性狀數(shù)據(jù)測量

對產(chǎn)區(qū)或藥材市場隨機進行多點取樣，收集不同農(nóng)戶或商戶各規(guī)格等級牡丹皮藥材，并對其進行性狀數(shù)據(jù)測量，每份樣品隨機取10個個體并用游標(biāo)卡尺測量牡丹皮藥材最粗處外徑、內(nèi)徑、皮部厚度，用直尺測量牡丹皮藥材的長度，用天平測量每個個體的質(zhì)量。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS分析

該部分內(nèi)容參見本課題組相關(guān)研究[17]。

2.4 UPLC-Q-Trap-MS-MS分析

該部分內(nèi)容參見本課題組相關(guān)研究[17]。

2.5 丹皮酚含量測定

丹皮酚含量測定方法參照《中國藥典》牡丹皮項下丹皮酚的含量測定方法[1]。

2.6 多糖含量測定

多糖含量測定方法見本課題組相關(guān)研究[17]。

3 實驗結(jié)果

3.1 商品調(diào)查

牡丹皮為常用大宗藥材，用量較大，產(chǎn)區(qū)較多(如安徽、重慶、河南、山東、陜西等省、直轄市均有栽培)，當(dāng)前主產(chǎn)區(qū)為安徽亳州。據(jù)本次產(chǎn)地及市場調(diào)查、走訪大戶等方式了解到當(dāng)前亳州產(chǎn)牡丹皮至少占全國牡丹皮產(chǎn)量的50%以上。此外，傳統(tǒng)以安徽銅陵等地最為知名，習(xí)稱“鳳丹皮”，重慶墊江丹皮亦較知名，兩者傳統(tǒng)奉為道地。而其他產(chǎn)地牡丹皮產(chǎn)量較少。產(chǎn)地加工是藥材商品規(guī)格等級形成的源頭，因此本研究對藥材主產(chǎn)區(qū)和傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)(亳州、銅陵、墊江)做了產(chǎn)地調(diào)查，對各產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)地加工分級做了歸納總結(jié)。在此基礎(chǔ)上，對國內(nèi)幾個大型藥材市場做了市場商品調(diào)查。

3.1.1 產(chǎn)地調(diào)查 亳州產(chǎn)區(qū)牡丹皮按照產(chǎn)地加工方法的不同分為“連丹皮”(因牡丹皮栓皮顏色較深，故不刮皮者又稱“黑丹皮”)和“刮丹皮”。抖凈泥土后，直接人工去心，或機器開縫去心者，稱為“連丹皮”。趁鮮刮去外皮再去心者，稱為“刮丹皮”。去除木心后，再人工揀選，一般較大者為大選貨，較小者為小選貨，或者不分大小，稱為統(tǒng)貨。此外，其產(chǎn)地加工中尚存在熏硫的現(xiàn)象。目前各藥材市場所見牡丹皮多數(shù)為亳州產(chǎn)牡丹皮。銅陵產(chǎn)區(qū)牡丹皮以人工去心方法為主。采挖根部，抖凈泥土帶回，略晾曬或不晾曬，剪下根條，直接剝?nèi)「?，較粗壯，無法剝者，用小錘輕錘，至皮破后，再剝?nèi)∧档て?。按直徑及品相分為不同的等級，最粗者稱為“一條”，次粗者稱“二條”，最細者稱“三條”；另外還挑選條勻直、皮細、長度約5～8 cm、中部圍粗0.6～1 cm者，稱為“標(biāo)二條”，為最貴的一種等級，據(jù)多家收購商介紹，專供出口；極細無法抽去木心者稱為“尾根”(不符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn))；靠近地上部分者，品相差，易碎，稱為“大頭殼”(不符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn))。分級后分別晾曬至干燥。銅陵產(chǎn)牡丹皮一般不去皮，不熏硫，多為曬干或陰干，抽心率幾乎可以達到100%，雜質(zhì)也較少，一般認為品質(zhì)較好。除在銅陵本地小型收購戶見到銅陵丹皮，在國內(nèi)各大藥材市場均少見。因此，本次標(biāo)準(zhǔn)制訂中，銅陵產(chǎn)牡丹皮規(guī)格等級劃分以在銅陵本地采集樣品為基礎(chǔ)。墊江牡丹皮加工去心均為人工去心，加工方法基本一致。一般按照加工方法分為“連丹皮”和“刮丹皮”，“連丹皮”和“刮丹皮”規(guī)格下，又按照直徑分為選貨和統(tǒng)貨。因目前墊江藥用牡丹皮的種植受觀賞牡丹高利潤的沖擊，產(chǎn)量逐年下降，商品量較少，除了在重慶解放路藥材專業(yè)市場及荷花池藥材市場見過少量出售，其他藥材市場均未見墊江牡丹皮商品。因此，本次牡丹皮藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)制訂時未將“川丹皮”單列為一個規(guī)格。

3.1.2 市場調(diào)查 市場所見牡丹皮藥材主要為安徽亳州產(chǎn)牡丹皮，西南地區(qū)市場尚有墊江丹皮規(guī)格，依據(jù)加工方法，分為“連丹皮”和“刮丹皮”。除此以外，市場上尚存在較多熏硫丹皮，熏硫丹皮通體色白，有酸味。市場上牡丹皮藥材主要依據(jù)牡丹皮直徑大小、抽心率、含雜率等劃分為大選貨、小選貨、大統(tǒng)貨、小統(tǒng)貨和統(tǒng)貨。不同藥材市場，不同商戶間對不同等級的牡丹皮的稱呼有所不同；除牡丹皮藥材外，尚有牡丹皮切制成片的形式，分級亦根據(jù)大小、抽心率、雜質(zhì)含量等，有大選片、小選片、大統(tǒng)片、小統(tǒng)片、統(tǒng)片等。

3.1.3 小結(jié) 根據(jù)產(chǎn)地及市場調(diào)查，牡丹皮藥材當(dāng)前劃分商品規(guī)格等級的主要方法為：根據(jù)產(chǎn)地不同劃分規(guī)格，再根據(jù)去皮與否分成“連丹皮”與“刮丹皮”兩個規(guī)格，各規(guī)格下根據(jù)藥材長度、直徑以及抽心率做等級劃分。市場流通過程中牡丹皮藥材規(guī)格等級劃分詳見表1，且市場上一般認為長度越長、直徑越大、抽芯率越高，其質(zhì)量越好，價格越高。

表1 市場流通過程中牡丹皮規(guī)格等級劃分情況

3.2 性狀數(shù)據(jù)分析

根據(jù)以上研究結(jié)果，牡丹皮藥材品質(zhì)受產(chǎn)地影響因素較少，而“鳳丹皮”因傳統(tǒng)奉為道地，單獨設(shè)為一個規(guī)格，其他產(chǎn)地歸并。產(chǎn)地規(guī)格下根據(jù)去皮與否分為“連丹皮”與“刮丹皮”，抽心率應(yīng)嚴格控制在《中國藥典》限定值內(nèi)。而等級則根據(jù)性狀進行劃分，本研究對所取樣品的長度、外徑、內(nèi)徑、皮部厚度、個體重量分別作了測量并進行了統(tǒng)計分析，提取核心劃分指標(biāo)，以便于市場操作。

結(jié)果表明，不同等級的牡丹皮藥材的長度為6.9～20.3 cm，均值為11.2 cm；外徑0.37～1.38 cm，均值為0.92 cm；內(nèi)徑為0.11～0.8 cm，均值為0.44 cm；皮部厚度為0.16～0.36 cm，均值為0.28 cm；個體質(zhì)量為1.2～17.5 g，均值為5.8 g?！吨袊幍洹芬?guī)定連丹皮藥材長5～20 cm，直徑0.5～1.2 cm，厚0.1～0.4 cm?；痉稀吨袊幍洹吠庥^性狀要求。

因每家每戶劃分稍有差異，稱呼不同，因此先用Excel表格對各測量量的最大值、最小值及均值進行粗略統(tǒng)計，將樣品性狀測定值差異不大的歸為一類(因市場上牡丹皮等級的劃分主要依據(jù)其外徑大小，故歸并時以外徑的均值作為主要歸并的依據(jù))，再用SPSS 12.0軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

3.2.1 銅陵牡丹皮性狀數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 12.0軟件，對所有直徑與長度的數(shù)據(jù)進行非參數(shù)的K-S檢驗，發(fā)現(xiàn)長度、外徑、內(nèi)徑、皮部厚度的P>0.05(見表2)，說明測定數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。將所有銅陵產(chǎn)不同等級的牡丹皮藥材的長度、外徑、內(nèi)徑、皮部厚度及個體質(zhì)量的測定數(shù)據(jù)進行單樣本T檢驗，設(shè)置置信區(qū)間百分比為99%，計算不同等級牡丹皮的長度、外徑、內(nèi)徑、皮部厚度的上限和下限(統(tǒng)一置信水平，避免主觀因素的影響，結(jié)果見表3)。由置信區(qū)間計算出的各規(guī)格等級性狀數(shù)據(jù)分布范圍如表3所示。

表2 單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗

表3 由置信區(qū)間計算出的各等級性狀數(shù)據(jù)分布范圍

綜合考慮牡丹皮藥材的長度、外徑、皮部厚度、內(nèi)徑的數(shù)值及對牡丹皮藥材等級劃分的影響，將4個因素的權(quán)重設(shè)定為：外徑>長度>皮部厚度>內(nèi)徑。

3.2.2 其他產(chǎn)地牡丹皮藥材性狀數(shù)據(jù)測定及數(shù)據(jù)分析 其他產(chǎn)地牡丹皮藥材性狀數(shù)據(jù)測定及數(shù)據(jù)處理方法同銅陵牡丹皮。單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗結(jié)果見表4，由置信區(qū)間計算出的各等級性狀數(shù)據(jù)分布范圍如表5所示。

表4 單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗

牡丹皮藥材商品規(guī)格等級的劃分以長度和外徑為主要劃分因素，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明：銅陵一等長度為11.3～13.3 cm，外徑為10.59～12.03 mm；銅陵二條的長度為9.03～10.91 cm，外徑為9.04～11.01 mm；銅陵三條的長度為7.38～9.14 cm，外徑為5.09～5.92 mm；銅陵標(biāo)二條的長度為9.36～11.06 cm，外徑為7.20～8.26 mm。其他產(chǎn)地大選貨長度為13.05～15.21 cm，外徑為12.60～14.15 mm；小選貨長度為9.57～11.16 cm，外徑為10.00～10.83 cm；統(tǒng)貨長度為7.90～9.18 cm，外徑為7.11～7.86 mm。

3.2.3 小結(jié) 性狀劃分中，不同因素權(quán)重為：外徑>長度>皮部厚度>內(nèi)徑，由于內(nèi)部直徑與皮部厚度受不同部位測定差異較大，且不好操作，因此選擇長度與直徑作為性狀劃分依據(jù)。

3.3 不同產(chǎn)地牡丹皮差異成分研究

牡丹皮藥材市場有根據(jù)產(chǎn)地分規(guī)格的情況，傳統(tǒng)有分“鳳丹皮”“瑤丹皮”“川丹皮”等，然僅靠性狀較難準(zhǔn)確區(qū)分，因此存在各地混雜的情況，然而各產(chǎn)區(qū)之間所產(chǎn)牡丹皮是否存在較大質(zhì)量差異，是否有必要按照產(chǎn)區(qū)劃分規(guī)格，尚需進一步的研究，基于此，本研究對亳州、銅陵及墊江3個代表性產(chǎn)區(qū)進行取樣并對其內(nèi)在成分做了系統(tǒng)的定性與定量比較分析，為產(chǎn)地規(guī)格的制訂提供依據(jù)。

3.3.1 實驗材料來源 鮮牡丹皮樣品：2017年8月至9月本文作者于墊江、亳州及銅陵采集4年生牡丹樣品各10株，趁鮮去除木心，于30 ℃烘干(48 h)，備用。打粉，粉末過《中國藥典》3號篩，備用。牡丹皮藥材：2016年4月至2017年11月從各產(chǎn)地采集的牡丹皮藥材。粉碎，粉末過《中國藥典》3號篩，備用。

3.3.2 不同產(chǎn)地牡丹皮次生代謝產(chǎn)物差異分析 牡丹皮中主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜進行推測，在總結(jié)對照品裂解規(guī)律的基礎(chǔ)上，根據(jù)色譜峰保留時間、質(zhì)譜碎片結(jié)合裂解規(guī)律及相關(guān)文獻資料進行結(jié)構(gòu)推測。對供試品進行UPLC-Q-TOF-MS分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Masslynx 4.1軟件中自帶的數(shù)據(jù)庫以及Chemspider(http：//www.chemspider.com/)及Scifinder(https：//scifinder.cas.org/)得到可能的分子式及候選化合物。根據(jù)二級質(zhì)譜碎片及對照品裂解規(guī)律，結(jié)合DAD特征光譜與化合物ClogP值等信息，以及芍藥屬已報道的相關(guān)研究進行成分鑒定。對不同牡丹皮樣品進行差異成分進行分析，將LC-MS所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到QI中，采用主成分分析(PCA)將不同產(chǎn)地藥材分別聚成不同組別，由圖1A可以看出，墊江與安徽(亳州和銅陵)產(chǎn)牡丹皮都可以明顯區(qū)分，說明不同產(chǎn)地牡丹皮在化學(xué)成分上存在差異；采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)，選取Loadings絕對值大于0.10的作為差異峰，共得到14個潛在差異峰。其中，有些峰為同一個化合物的不同碎片，這些峰共代表了11個潛在的差異化合物，對其進行了結(jié)構(gòu)推測。墊江與安徽產(chǎn)牡丹皮差異成分及相對峰面積強度見圖1D，其相關(guān)化合物信息見本課題組相關(guān)研究[17]。

表5 由置信區(qū)間計算出的各等級性狀數(shù)據(jù)分布范圍

注：A.綠色圈內(nèi)為安徽樣品，紅色圈內(nèi)為墊江樣品；B.S-Plot圖；C.OPLS-DA圖；D.不同產(chǎn)地牡丹皮差異成分(相同名稱代表同分異構(gòu)體)。圖1 不同產(chǎn)地牡丹皮的PCA聚類圖

3.3.3 不同產(chǎn)地牡丹皮丹皮酚含量測定結(jié)果 丹皮酚在牡丹皮中含量較高，味微辣，具有芳香氣味，具有抗菌、抗病毒等作用[18-19]，易析出結(jié)晶，即傳統(tǒng)性狀鑒別牡丹皮的“亮銀星”，傳統(tǒng)認為亮銀星多、氣味濃郁者佳，但丹皮酚易揮發(fā)，與儲存時間及條件因素相關(guān)。不同產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚含量測定結(jié)果如圖2所示(各產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚含量測定結(jié)果詳見本課題組相關(guān)研究[17])，從圖2中可以看出不同產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚含量高低順序為亳州略高于銅陵，銅陵略高于墊江，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果與文獻[20-21]的研究結(jié)果一致。

圖2 不同產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚含量

3.3.4 不同產(chǎn)地牡丹皮多糖含量測定結(jié)果 此項含量測定所用實驗材料為各產(chǎn)地所采牡丹皮藥材。不同產(chǎn)地牡丹皮中多糖含量測定結(jié)果如圖3所示(各產(chǎn)地牡丹皮樣品信息及丹皮酚含量測定結(jié)果詳見本課題組相關(guān)研究[17])，從圖3中可以看出不同產(chǎn)地牡丹皮中多糖含量高低順序為墊江丹皮高于銅陵及亳州牡丹皮，銅陵牡丹皮中多糖含量略高于亳州，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 不同產(chǎn)地牡丹皮中多糖含量

3.3.5 小結(jié) 牡丹皮藥材主要產(chǎn)區(qū)為安徽銅陵、亳州及重慶墊江，其中以亳州為主，銅陵丹皮傳統(tǒng)質(zhì)量佳，但因產(chǎn)量較少，多被制劑企業(yè)直接收購而較少進入市場流通。通過液質(zhì)聯(lián)用及聚類分析可知，安徽與重慶產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)牡丹皮成分存在一定差異，主要為丹皮酚苷、芍藥苷及沒食子酸類成分，但僅在各自含量上有所區(qū)別，但幅度不大；而丹皮酚、多糖的含量3個產(chǎn)地均無顯著性差異，可見各產(chǎn)區(qū)之間在相同年限下牡丹皮藥材成分差異不顯著，此與牡丹為廣布種有關(guān)，受生境變化影響不大，且均在長江流域。此外鳳丹皮因栽培歷史悠久，栽培與加工較為考究，知名度高，被奉為道地，其分級較為細致?？梢娔档てど唐焚|(zhì)量與產(chǎn)地生境因素較少，而與加工技術(shù)有關(guān)，鑒于鳳丹皮細致的分級，且《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》亦單獨將其劃分為一個規(guī)格，因此本次制訂亦按照傳統(tǒng)方法，將其單獨劃分為一個規(guī)格。

3.4 牡丹皮不同部位差異成分研究

牡丹皮目前市場上按照去皮與否分為“連丹皮”與“刮丹皮”，歷代本草較少提及牡丹皮去皮的記載，這種按照去皮與否進行規(guī)格的劃分始于近代。此外木心作為非要用部位現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)要求其不得超過3%，而目前市場存在較多不符合規(guī)定的商品。目前相關(guān)研究甚少，需要做深入的分析，以驗證其去皮與去心的科學(xué)性。

3.4.1 實驗材料 2017年9月本文作者從亳州采得牡丹樣品共10 株，趁鮮分離栓皮、韌皮和木心，(保證栓皮與韌皮之間，韌皮與木心之間的過渡區(qū)完全去除)于30 ℃烘干(48 h)，備用。

3.4.2 UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)分析

3.4.2.1 PCA OPLS-DA 多元統(tǒng)計分析 對牡丹根不同部位進行Q-TOF-MS分析，因負離子模式下可獲得豐富的離子碎片，因此采用負離子模式進行測定，其總離子流色譜圖見圖4。從總離子流圖中可以看出牡丹根栓皮中含有的化學(xué)成分的種類和數(shù)量最多，木心最少。將所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到QI軟件中，進行PCA聚類分析，差異成分分析見圖5A，從圖中可見牡丹根不同部位可以較好的聚在一起，說明3者成分差異較大。

注：A.栓皮；B.韌皮；C.木心。圖4 牡丹根不同部位總離子流圖

注：A.PCA聚類圖；B.韌皮-栓皮S-plot圖；C.栓皮-木心S-plot圖；D.韌皮-木心S-plot圖。圖5 牡丹根部不同部位成分的差異分析圖

3.4.2.2 牡丹根不同部位化學(xué)成分的OPLS-DA分析 在PCA分析基礎(chǔ)上，借助OPLS-DA對數(shù)據(jù)進行二維數(shù)據(jù)分析，從而得到牡丹皮數(shù)據(jù)散點圖，見圖5B，5C，5D。散點圖中每個點代表RT-EM數(shù)據(jù)，橫軸(X軸)表示可變量，數(shù)據(jù)點離原點越遠，該點對樣品分組差異的貢獻值也就越大。因而選取S型曲線兩端，選取Loadings絕對值小于等于0.1的點，作為可信度高的特征離子，其相對含量見圖6。同時將QI中質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel表格中，并將OPLS-DA篩選出的特征離子挑出，比較不同部位特征離子的相對含量差異。

3.4.2.3 差異成分鑒別 對3.1.2項下篩選出的具有顯著性差異的變量，進行質(zhì)譜解析，牡丹根各部位差異成分差異見圖6，其多為芍藥苷類、沒食子鞣質(zhì)類及丹皮酚苷類成分。

注：A.栓皮-韌皮；B.栓皮-木心；C.韌皮-木心；相同名稱代表同一化合物的不同碎片或同分異構(gòu)體。圖6 牡丹根各部位化學(xué)成分差異

3.4.3 UPLC-QTRAP-MS-MS定量測定結(jié)果 采用三重四級桿質(zhì)譜對牡丹根不同3 個部位中的10 個主要指標(biāo)性成分即沒食子酸、丹皮酚原苷、沒食子酸甲酯、氧化芍藥苷、丹皮酚、五沒食子酰葡萄糖苷、苯甲酰氧化芍藥苷、丹皮酚新苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷進行了定量分析，根據(jù)樣品中各化合物的含量選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中各成分的含量。含量測定結(jié)果見圖7(樣品信息及含量測定結(jié)果詳見本課題組相關(guān)研究[17])。結(jié)果表明：總體來看，牡丹根栓皮中所含有的化學(xué)成分的含量最高；牡丹根丹皮酚含量以栓皮及韌皮中較多，木心中最少；丹皮酚原苷的含量以韌皮及木心中最多，栓皮中最少；丹皮酚新苷的含量以韌皮中最多，栓皮及木心中較少；芍藥苷類成分均以栓皮中含量為最高；各部位沒食子酸的含量差異不明顯，沒食子酸甲酯含量以木心為最，韌皮次之，栓皮中最少；五沒食子酸葡萄糖苷的含量以木心為最多，韌皮及栓皮中含量較少。

圖7 牡丹根各部位化學(xué)成分含量差異

3.4.4 小結(jié) 牡丹根的不同部位即栓皮、韌皮及木心三者之間成分各不相同，其中栓皮中所含化合物種類最為豐富，其中芍藥苷類和鞣質(zhì)類成分的種類和數(shù)量均較多，鞣質(zhì)類成分含有多數(shù)酚羥基，具有較強的抗氧化性，且容易氧化或聚合后顏色加深，因而牡丹皮栓皮顏色較韌皮及木心深，可能與此相關(guān)。目前市場以刮皮與否分成“連丹皮”與“刮丹皮”，而清以前的本草文獻中均未提及牡丹皮加工需要去除栓皮，去皮更多基于商品外觀品相出發(fā)，是否合理有待進一步的研究?？紤]到加工成本及牡丹皮傳統(tǒng)加工方法，建議牡丹皮在加工的過程不去皮。

牡丹根的韌皮部中丹皮酚原苷、丹皮酚新苷及丹皮酚在的含量均較高，這類成分易形成結(jié)晶。此與傳統(tǒng)認為牡丹皮以氣香濃郁、亮銀星多者為佳的說法較為一致。

木心中所含化學(xué)成分的種類最少，且多種化學(xué)成分的含量均較低，究其原因，可能是木心在牡丹中主要起支撐的作用，主要含有質(zhì)韌的木纖維，而含有的次生代謝產(chǎn)物的種類較少，也驗證了牡丹皮在加工的過程中需去除木心的科學(xué)合理性，因此當(dāng)前市場將抽心率高低作為等級劃分是有依據(jù)的，木心多勢必影響藥材質(zhì)量，但是目前超過《中國藥典》非藥用部位的限量是不合理的，因此本次制訂將木心的限量嚴格控制在《中國藥典》限量范圍內(nèi)。

此外，丹皮酚原苷、丹皮酚新苷及丹皮酚在韌皮中含量均較高；丹皮酚新苷和丹皮酚原苷在栓皮中均較低，而丹皮酚在栓皮中含量較高?？赡艿脑蚴堑てし釉蘸偷てし有萝障鄬Ψ€(wěn)定，其在韌皮部中產(chǎn)生、聚集并轉(zhuǎn)化為丹皮酚，轉(zhuǎn)運到栓皮，通過栓皮發(fā)揮保護作用。

本研究也解釋了張雨鳳等[13]研究的結(jié)論，即：在不同等級牡丹皮中，四等牡丹皮因徑直細，皮所占比例相對大，因此其芍藥苷含量最高，一等牡丹皮中丹皮酚含量最高；芍藥苷含量在主根中最少，在支根中最多；市場上連丹比刮丹中芍藥苷含量高，刮丹比連丹中丹皮酚含量高。因牡丹皮藥材越細，栓皮所占的比例越大，芍藥苷的含量越高，丹皮酚的含量越低。

3.5 不同等級牡丹皮化學(xué)成分與性狀相關(guān)性研究

牡丹皮藥材歷來根據(jù)長度、直徑及碎節(jié)率進行等級劃分，其中碎節(jié)是指小的碎段，是為了后續(xù)飲片切制方便出發(fā)，而長度與直徑與內(nèi)在質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)性研究尚少，且多僅比較丹皮酚等幾個指標(biāo)性成分的含量，而忽略傳統(tǒng)認為的粉性足的品質(zhì)評價，因此本次研究除對丹皮所含主要成分進行多指標(biāo)含量測定外，還開展了多糖類成分與性狀之間的關(guān)聯(lián)性研究，以更加科學(xué)合理的制訂標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

3.5.1 實驗材料 樣品1～28為2016年5月至2017年10月由筆者從亳州、銅陵、墊江各牡丹皮產(chǎn)地及河北安國藥材市場、亳州藥材市場、成都荷花池藥材市場采集。

3.5.2 次生代謝產(chǎn)物含量測定 樣品信息及次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果見詳見本課題組相關(guān)研究[17]。所有樣品中沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)在0.050%～0.274%，其均值為0.112%；丹皮酚原苷的質(zhì)量分數(shù)為0.011%～1.677%，均值為0.521%；沒食子酸甲酯的質(zhì)量分數(shù)為0.023%～0.343%，均值為0.189%；氧化芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)為0.246%～0.728%，均值為0.444%；丹皮酚的質(zhì)量分數(shù)為2.971%～7.298%，均值為5.010%；五沒食子酸葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)為0.064%～0.158%，均值為0.098%；苯甲酰氧化芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)為0.043%～0.157%，均值為0.083%；丹皮酚新苷的質(zhì)量分數(shù)為0.012%～3.526%，均值為1.207%；芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)為0.858%～2.591%，均值為1.644%；苯甲酰芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)為0.108%～0.764%，均值為0.328%，各規(guī)格等級樣品次生代謝產(chǎn)物含量測定結(jié)果及樣品信息詳見表6。

3.5.3 多糖含量測定 各規(guī)格等級樣品多糖含量測定結(jié)果及樣品信息見表7。不同等級牡丹皮多糖質(zhì)量分數(shù)在5.01%～8.85%，均值為6.78%。不同等級之間牡丹皮中多糖的含量存在差異，隨著牡丹皮藥材由大到小，其多糖含量呈下降的趨勢，而與牡丹皮產(chǎn)地?zé)o關(guān)。此外，觀察到牡丹皮中多糖的含量還與其熏硫程度有一定的關(guān)系，高硫樣品中多糖含量較高，這可能與溶出度有關(guān)。

表6 牡丹皮性狀數(shù)據(jù)與次生代謝產(chǎn)物含量

續(xù)表6

表7 牡丹皮性狀數(shù)據(jù)與多糖含量

3.5.4 不同等級牡丹皮次生代謝產(chǎn)物含量與性狀相關(guān)性分析 以次生代謝產(chǎn)物含量、性狀數(shù)據(jù)做Pearson直線相關(guān)分析(SPSS 12.0)，結(jié)果如表8所示，各性狀數(shù)據(jù)之間均呈正相關(guān)性；芍藥苷類成分之間均呈顯著正相關(guān)性；除五沒食子酰葡萄糖苷以外，其他次生代謝產(chǎn)物含量均與其外觀性狀大小呈負相關(guān)性，且多數(shù)呈顯著的負相關(guān)關(guān)系。

表8 牡丹皮次生代謝產(chǎn)物含量與性狀相關(guān)性

續(xù)表8

注：*P<0.05，**P<0.01。

3.5.5 小結(jié) 牡丹皮外觀性狀大小與主要次生代謝產(chǎn)物芍藥苷類的含量多呈負相關(guān)性，而與多糖含量呈正相關(guān)性。究其原因可能為牡丹皮中次生代謝產(chǎn)物芍藥苷等在栓皮中分布較多，直徑越大，栓皮所占比例越小，含量越低；而多糖多分布于韌皮部，直徑越大，其含量越高。而目前關(guān)于牡丹皮發(fā)揮不同藥理活性的對應(yīng)成分依然不明確，越來越多的研究表明，多糖等大分子成分也在發(fā)揮相應(yīng)的活性，因此不能僅根據(jù)牡丹皮藥材中化學(xué)成分的含量來判斷其品質(zhì)好壞。而傳統(tǒng)根據(jù)長度與直徑進行劃分從商品角度出發(fā)依然有價值，一方面對由于不同成分顯示不同的變化趨勢，然而整體幅度不大，不足以導(dǎo)致臨床療效的重大變化，另一方面為下游飲片切制帶來方便，切制過程需要大小分檔充分潤透，調(diào)整刀口，控制破碎片等，因此選擇條直均勻的藥材，可以減少耗損，且減少人工，因此從傳統(tǒng)來看，按照藥材長度直徑等劃分依然具有價值。

3.6 商品規(guī)格等級的制訂

綜合以上研究結(jié)果，對牡丹皮藥材的商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)不同的因素做了重新劃分如下：1)產(chǎn)地因素：各產(chǎn)地成分差異較小，考慮到傳統(tǒng)將鳳丹皮作為道地藥材，品質(zhì)佳，價格高，多供出口，因此仍延續(xù)《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》將其單獨定為一個規(guī)格，由于墊江丹皮，產(chǎn)量逐年萎縮，量較少，故未將川丹皮單獨作為一個規(guī)格，與其他產(chǎn)區(qū)歸并。故本次商品規(guī)格等級制訂按照產(chǎn)地將牡丹皮藥材分為“鳳丹皮”和“其他產(chǎn)地”丹皮。2)加工因素：不同部位成分差異較大，近代以來以刮皮與否劃分規(guī)格，目前市場也以此劃分，唯“鳳丹皮”在產(chǎn)地加工中不刮皮，故本次制訂鳳丹皮項下僅定“連丹皮”規(guī)格，其他產(chǎn)區(qū)項下劃分“連丹皮”和“刮丹皮”兩種規(guī)格。3)性狀因素：不同粗細的牡丹皮在化學(xué)成分上呈現(xiàn)與多糖正相關(guān)，而與芍藥苷等小分子分布于皮部的呈負相關(guān)，但幅度有限，為商品交易的可操作性角度出發(fā)，本次依然按照權(quán)重大小，以直徑與長度作為等級劃分依據(jù)。此外性狀范圍遵從《中國藥典》的要求。4)其他因素：市場上尚存在熏硫牡丹皮，表面色白，有酸味，按照含硫程度劃分為高、中、低等規(guī)格，其目的主要為了外觀品相及易于干燥，然而可致化學(xué)成分轉(zhuǎn)化，本課題組開展了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明其芍藥苷母核上的活潑羥基與二氧化硫及水反應(yīng)形成硫酸酯，應(yīng)加強鑒別[22]。本次標(biāo)準(zhǔn)制訂未根據(jù)市場按照熏硫程度劃分規(guī)格。

此外，市場上還存在加工成片(大量)或段(少量)的牡丹皮，這些丹皮片或段，粗細不一，且按抽心率高低進行劃分等級，均不符合《中國藥典》對丹皮藥材產(chǎn)地初加工的規(guī)定，且切制后易摻入抽心率較低的不合格片，加上丹皮酚易揮發(fā)，過早切片易造成其含量降低，因此，本次標(biāo)準(zhǔn)不包含該類藥材商品。

《中國藥典》已規(guī)定牡丹皮在產(chǎn)地加工中應(yīng)去除木心，并規(guī)定，除另有規(guī)定外，中藥中雜質(zhì)應(yīng)少于3%，本標(biāo)準(zhǔn)的制訂基于《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，因此符合本次牡丹皮商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)的藥材，首先應(yīng)當(dāng)符合《中藥藥典》相關(guān)規(guī)定，因此本標(biāo)準(zhǔn)對抽心率不另加限定。關(guān)于這些問題在劃分表的備注內(nèi)做了提示說明。牡丹皮商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)具體見表9。

表9 牡丹皮商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)劃分標(biāo)準(zhǔn)

注：1.鳳丹皮在產(chǎn)地加工中不刮皮，故鳳丹皮不按是否去皮劃分規(guī)格。
2.市場上尚存在熏硫牡丹皮，表面色白，有酸味，應(yīng)注意區(qū)分。
3.市場另有切制成片的牡丹皮商品，且多數(shù)抽心率低，應(yīng)注意區(qū)分。
4.對牡丹皮外觀大小與內(nèi)在成分間的關(guān)系進行了諸多研究，結(jié)果表明其粗細與內(nèi)在成分之間相關(guān)性不明顯，考慮到生產(chǎn)加工及市場交易所需，本標(biāo)準(zhǔn)尊重傳統(tǒng)與實際，仍按照長度及直徑進行等級劃分。

4 討論

由此可見，在采用現(xiàn)代理化指標(biāo)評價傳統(tǒng)根據(jù)外觀大小劃分不同等級時，應(yīng)注意有些成分的含量往往與其在植物體內(nèi)的分布相關(guān)，如：分布于皮部的，必然出現(xiàn)皮部占比多的成分相對含量高的現(xiàn)象，此時含量與藥材大小成負相關(guān)；分布于木質(zhì)部、髓部等部位的成分含量與藥材大小的成正相關(guān)。從不同角度會得出不同的結(jié)論，但是由于不同成分與臨床療效之間的對應(yīng)關(guān)系不明確，僅從單一成分類群的角度討論質(zhì)量好壞具有片面性，加之歷來延續(xù)的習(xí)慣，及后續(xù)生產(chǎn)實際所需，因此目前商品等級劃分依然延續(xù)傳統(tǒng)的劃分。而中藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)是一個應(yīng)用性標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)切合市場實際，要求簡便易行、可操作性強，不應(yīng)過分夸大由于大小粗細不同所帶來的差異。

此外，近年來隨著物流速度的加快，分工的日益細化，很多藥材的產(chǎn)地切制成為普遍現(xiàn)象，有些藥材在飲片加工的潤透環(huán)節(jié)需要的時間長，成分流失大，趁鮮切制具有優(yōu)勢。但是有些藥材過早切制則容易導(dǎo)致易揮發(fā)、易氧化等成分的散失，因此需要開展深入的研究，權(quán)衡利弊，科學(xué)制訂產(chǎn)地初加工及儲存標(biāo)準(zhǔn)。