金翹片體內(nèi)抗甲型H3N2流感病毒及禽流感病毒H9N2作用研究

張美義， 何家靖， 楊子峰， 楊兆麗， 楊家慶， 詹利之，曾慶慕， 馮麗玲， 李國橋， 朱宇同

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州 510405；2.廣州醫(yī)科大學(xué)廣州呼吸道疾病研究所，廣東廣州 510000）

金翹片是由金銀花、連翹、牛蒡子、甘草等9味中藥組成的復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效。前期經(jīng)體內(nèi)研究[1]證實(shí)：金翹片具有顯著的抗甲型H1N1流感病毒作用，能夠明顯抑制H1N1流感病毒導(dǎo)致的小鼠肺指數(shù)升高，提高死亡保護(hù)率和生命延長率，降低肺組織的病毒載量，提高γ干擾素（γ-IFN）水平（P＜0.05或P＜0.01）。本研究進(jìn)一步探討了金翹片對(duì)甲型H3N2流感病毒及禽流感病毒H9N2的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 金翹片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心藥學(xué)研究室提供，批號(hào)：070801、120501；給藥前用無菌蒸餾水配制成所需質(zhì)量濃度。利巴韋林（Rib.），由廣東肇慶星湖生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：L051075。銀翹解毒片由北京同仁堂科技發(fā)展公司制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：0124432。阿司匹林腸溶片為湖南新匯制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：09115。羅通定為四川金藥師制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：090401。

1.2 動(dòng)物 NIH小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量13～15 g，SPF級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。SD大鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量160～190 g，SPF級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度為（75±10）%，喂以標(biāo)準(zhǔn)鼠類塊料，自由飲用蒸餾水。

1.3 病毒株 甲型H3N2流感病毒鼠肺適應(yīng)株，由中國藥品生物制品檢定所提供，經(jīng)雞胚尿囊腔傳代增強(qiáng)毒力后，測(cè)定其半數(shù)致死量（LD50=10-3.50）（為20120717病毒液）。禽流感病毒H9N2鼠肺適應(yīng)株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供，經(jīng)雞尿胚囊腔傳代增強(qiáng)毒力后，以雞紅血細(xì)胞血凝來判斷其滴度，并測(cè)定半數(shù)致死量LD50為10-3.70。分裝封蓋，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)主要工作在廣州中醫(yī)藥大學(xué)原蟲與病毒實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4 主要試劑與儀器 無水乙醚（廣州化學(xué)試劑廠）。JD200-3型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；T500型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）。

1.5 動(dòng)物分組[2]甲型H3N2流感病毒模型：將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林組（劑量為75 mg/kg）、金翹片組[070801與120501共2批，低、中、高劑量分別為0.610、1.220、2.440 g（生藥）/kg]，共9組，每組10只。利巴韋林組和金翹片不同劑量組給予相應(yīng)劑量藥物，正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組給予等體積蒸餾水。除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠在乙醚輕度麻醉下，以15 LD50病毒液滴鼻感染，每只0.2 mL。于感染前1 d開始灌胃給藥，每天1次，每次0.2 mL/10 g（體質(zhì)量），連續(xù)5 d。

禽流感病毒H9N2模型：將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林組（劑量為75 mg/kg）和金翹片組[劑量為0.30 g（生藥）/kg]共4組，每組6～9只。各組給藥方式同H3N2模型，其中以15 LD50病毒液滴鼻感染，每只0.05 mL。灌胃給藥每次0.1 mL/10 g（體質(zhì)量），連續(xù)5 d。

1.6 金翹片對(duì)流感病毒感染小鼠胸腺的影響 給藥結(jié)束后，取出胸腺，稱質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)（%）=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.7 金翹片對(duì)流感病毒感染小鼠肺病變的影響 給藥結(jié)束后第2天，禁食禁水4 h以上，稱體質(zhì)量，處死，取出全肺，記錄病變程度；于生理鹽水中洗滌2次，用吸水紙吸干表面水分，稱肺質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。肺指數(shù)（%）=肺質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。肺指數(shù)抑制率（%）=（病毒對(duì)照組肺指數(shù)均數(shù)-用藥組肺指數(shù)均數(shù)）/病毒對(duì)照組肺指數(shù)均數(shù)×100%。

1.8 金翹片的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用

1.8.1 對(duì)干酵母所致大鼠發(fā)熱的解熱作用[2]取大鼠60只，體質(zhì)量160～190g，將大鼠隨機(jī)分為6組，即生理鹽水組、銀翹解毒片組[1.12 g（生藥）/kg]、金翹片組[低、中、高劑量分別為0.305、0.610、1.220 g（生藥）/kg]、阿司匹林組（0.1 g/kg），每組10只。致熱前各組大鼠禁食（不禁水）8 h，然后按前述劑量各組給藥1次。給藥后立即給予大鼠背部皮下注射20%酵母懸液10 mL/kg致熱，于致熱后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h各測(cè)大鼠體溫1次。

1.8.2 對(duì)小鼠熱板致痛的影響[2]采用小鼠熱板法，控制實(shí)驗(yàn)溫度為18℃，熱板溫度為（55±0.5）℃。以小鼠放于熱板上后出現(xiàn)舔足所需時(shí)間作為痛閾值。取痛閾合格（5～30 s）雌性NIH小鼠72只隨機(jī)分為6組，即生理鹽水組、銀翹解毒片組[2.24 g（生藥）/kg]、金翹片組[低、中、高劑量分別為0.610、1.220、2.440 g（生藥）/kg]、羅通定組（30 mg/kg）。每組12只。測(cè)定用藥前、用藥后0、30、60、90 min的小鼠痛閾值。

1.8.3 對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響[2]取大鼠60只，體質(zhì)量160～190 g，將大鼠隨機(jī)分為6組，即生理鹽水組、銀翹解毒片組[1.12 g（生藥）/kg]、金翹片組[低、中、高劑量分別為0.305、0.610、1.220 g（生藥）/kg]、阿司匹林組（0.1 g/kg），每組10只。以1%的角叉菜為致炎劑，分別在大鼠右后肢足跖皮下注射0.1 mL。致炎前測(cè)定各組大鼠右后跖的正常體積，致炎后0、1、2、3、4、5、6 h再測(cè)定各組大鼠右后跖的體積。記錄結(jié)果，按下式計(jì)算腫脹率：腫脹率（%）=[（致炎后足跖容積-致炎前足跖容積）/致炎前足跖容積]（100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金翹片對(duì)甲型H3N2流感病毒感染鼠肺病變的抑制作用 表1～3結(jié)果顯示，在本次實(shí)驗(yàn)條件下，病毒對(duì)照組肺指數(shù)為2.030，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明造模成功。利巴韋林肺指數(shù)抑制率為62.3%，具有明顯的抑制肺病變作用。2批金翹片（070801、120501）肺指數(shù)抑制率介于35.7%～54.3%，均具有明顯的抑制肺病變作用，量效關(guān)系明顯，且對(duì)小鼠體質(zhì)量及胸腺均無明顯的抑制作用。

2.2 金翹片對(duì)禽流感病毒H9N2感染鼠肺病變的抑制作用 表4結(jié)果顯示，明金翹片對(duì)禽流感病毒H9N2具有較顯著的抑制作用。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較Table 1 Comparison of the body mass of mice in various groups (-x±s)

表2 各組小鼠肺指數(shù)比較Table 2 Comparison of the lung index in mice of various groups

表3 各組小鼠胸腺指數(shù)比較Table 3 Comparison of the thymus index in mice of various groups (-x±s)

2.3 金翹片的解熱作用 表5結(jié)果表明，給藥后2 h金翹片明顯抑制大鼠體溫升高并持續(xù)至10 h（P＜0.05或P＜0.01），起效快，且持續(xù)時(shí)間長，而相同劑量的銀翹解毒片[1.22 g（生藥）/kg]僅在8～10 h表現(xiàn)較明顯的體溫抑制作用，且持續(xù)時(shí)間較短。

表4 各組小鼠肺指數(shù)比較Table 4 Comparison of the lung index in mice of various groups

2.4 金翹片的鎮(zhèn)痛作用 表6結(jié)果表明，給藥后金翹片能明顯提高小鼠痛閾值，明顯提高小鼠痛閾百分率（P＜0.05或P＜0.01），持續(xù)90 min，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于同劑量銀翹解毒片（P＜0.05）。

2.5 金翹片的抗炎作用 表7結(jié)果表明，生藥劑量為0.610～1.220 g/kg的金翹片在致炎后3 h開始明顯抑制足跖腫脹（P＜0.05或P＜0.01），而銀翹解毒片在致炎后4 h開始發(fā)揮作用，強(qiáng)度弱于金翹片。

表5 金翹片對(duì)干酵母所致大鼠體溫的影響Table 5 Effect of Jinqiao Tablets on temperature alternation in rats induced by dry yeast (-x±s)

表6 金翹片對(duì)小鼠熱板法痛閾的影響Table 6 Effect of Jinqiao Tablets on hot-plate induced pain threshold in mice (-x±s)

表7 金翹片對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響Table 7 Effect of Jinqiao Tablets on carrageenan-induced pedal swelling in rats (-x±s)

3 討論

流感病毒的不斷流行主要在于病毒表面的2種糖蛋白抗原—血球凝集素（hemagglutinin，H）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，N）的不斷進(jìn)化。由于H和N抗原容易變化而產(chǎn)生新的亞型，此時(shí)人類往往對(duì)新亞型的免疫力不強(qiáng)而引起不同程度的流行。H3N2型流感1968年首次在香港發(fā)生[3]，但和H1N1、H7N9等類似，至今仍然是人群中流行的主要流感亞型。H9N2亞型禽流感病毒可以感染人，同時(shí)還是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等感染人的流感病毒的內(nèi)部基因的供體[4]。

中醫(yī)藥治療病毒性感染疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，不僅療效確切，耐藥性低，副作用和不良反應(yīng)少，還有抑菌、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等標(biāo)本兼治的綜合功效[5]。中草藥抗流感病毒主要有2條途徑：直接滅活或抑制病毒和通過誘生干擾素或調(diào)節(jié)人體免疫功能而間接抗病毒[6]。由于前期的研究表明金翹片具有明顯的抗H1N1流感病毒作用，其作用明顯強(qiáng)于同等劑量下的銀翹解毒片及蓮花清瘟膠囊，甚至相當(dāng)于化學(xué)藥達(dá)菲，這與復(fù)方中某些具有突出抗病毒作用的藥味及本復(fù)方成型采用的工藝是密切相關(guān)的。一般藥理研究表明，金翹片同時(shí)具有顯著的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，這對(duì)于解除流感所致的發(fā)熱、咳嗽、咽痛等具有重要作用。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，目前已上市的蓮花清瘟膠囊（片/顆粒）、金花清感顆粒等抗感冒中藥復(fù)方尚未有關(guān)于抗禽流感病毒H9N2方面的研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，本研究通過擴(kuò)大試驗(yàn)病毒種類，進(jìn)一步證實(shí)了金翹片同時(shí)具有一定的抗甲型H3N2流感病毒及抗禽流感病毒H9N2作用。

（同等貢獻(xiàn)作者：李國橋，張美義，何家靖，楊兆麗，楊子峰）